食品微生物检验学实验指导 0308.docx

1、食品微生物检验学实验指导 0308食品微生物检验学实验指导2013-3-19实验1 菌落总数测定 主要内容：1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种与琼脂倾注；3）24h后菌落计数及结果报告。实验2 大肠菌群MPN测定 主要内容：1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种于乳糖胆盐发酵管，培养；3）24h后观察产酸产气情况，划线于EMB琼脂，培养；3）48h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；4）查MPN检索表，报告结果。实验3 大肠杆菌检验主要内容：1）样品前处理； 2）增菌 （肠道增菌液）； 3）分离（麦康凯或伊红美蓝琼脂）； 4）革兰氏染色、镜检； 5）生化试验（TSI， pH7.2尿素，甲基红试验

2、和吲哚试验，V-P试验和枸橼酸盐试验）实验4 金黄色葡萄球菌检验 主要内容：1）将金黄色葡萄球菌和链球菌肉汤培养物划线于普通琼脂、血液琼脂，接种生化培养基，进行纸片法药敏试验，培养；2）24h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；3）观察主要生化试验结果和药敏试验结果。4）报告。实验5 魏氏梭菌检验 主要内容：1）细菌筛选 （亚硫酸盐多粘菌素磺胺嘧啶，SPS琼脂）；2 细菌培养（液体硫乙醇酸盐培养基，FT培养基）；3）动力硝酸盐还原实验；4）暴烈发酵实验；5）卵黄脂酶水解实验。实验6 罐头食品检验 主要内容：1）罐头感观检查；2）pH值测定；3）染色镜检；4）接种培养（庖肉培养，溴甲酚紫葡萄糖肉糖

3、，麦芽浸膏汤）5）平板筛选（锰盐营养琼脂平板，血琼脂平板，卵黄琼脂平板）实验7 PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌主要内容：1) 以鼠伤寒沙门氏菌以SdiA为模板设计引物：(PCR 产物长度：562bpFsdiA: 5-tgg cag cag agg atg ttt at-3RsdiA 5-tcg atc tcc gat gag gtc tt-32) 细菌单克隆水悬浮后做模板，做PCR3) 电泳检测是否扩出条带。实验8 霉菌检验 主要内容：1）样品稀释 2）平板接种培养（马铃薯葡萄糖琼脂，孟加拉红琼脂）；3）菌落计数实习周: 鸡蛋中沙门氏菌筛选、分离、生化鉴定及嗜菌体检测主要内容：（一）样品前处理及增

4、菌培养；（二）沙门氏菌在选择平板上菌落特征观察；（三）沙门氏菌染色特性和生化特性观察；（四）沙门氏菌噬菌体鉴定。实验一 菌落总数测定目的与要求1.通过本试验要求掌握食品的菌落总数测定的方法，菌落计数和报告方式，以及经常食用的各类动物性食品的菌落总数标准。2.菌落总数是指食品检样经过适当处理，在一定的条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数，其也是判定食品被污染程度的标志。实验器材及试剂 温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、稀释液、营养琼脂、牛奶等。 实验内容（一）检样稀释及培养：1.以无菌操作，将检样（牛奶）0.5ml放于含有4.5mL灭菌生理盐水试管内，经充分振摇或研磨作成1

5、：10的均匀稀释液。2.用无菌移液器吸取1：10稀释液0.5ml，注入含有4.5mL灭菌生理盐水的试管中振摇试管混合均匀，作成1：100倍稀释。3.更换枪头后，再用无菌移液器，按（2）操作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次换一只1mL无菌枪头。4.根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，用移液器吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作2个平皿。5.稀释液移入平皿后，应立即将冷至46 左右营养琼脂培养基（可放置46 水浴中保温）注入平皿约15-20 ml，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lml灭菌稀释液的灭菌平皿内，作空白对

6、照。6.待琼脂凝固后，翻转平板，置37温箱内培养482h。（二） 菌落计数1 选取30-300 CFU 之间，无蔓延生长的、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。（三） 结果与报告1 菌落总数的计算方法1.

7、1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：N=C/(n1+ 0.1 n2)d （1）式中：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。示例：稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度菌落数（CFU）232，24433，35N=C/(n1+ 0.1 n2)d = (232+244+33+35)

8、/2+(0.12) 10-2 = 544/0.022 = 24727上述数据按2.2数字修约后，表示为25000或2.5104。1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接

9、近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。2 菌落总数的报告2.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。2.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。思考题1 菌落总数的食品卫生学意义？2 影响本实验结果的因素有

10、哪些？实验二 大肠菌群数的测定目的与要求 1掌握大肠菌群MPN的测定原理与方法，及实验结果报告方式。2了解大肠菌群的食品卫生学意义原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（themostprobablenumber-简称MPN）表示。实验器材及试剂样品：牛乳 温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、月桂基

11、硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水等。实验内容一、常规检验法1检样稀释及培养 取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同,做成10倍递减的均匀系列稀释液，从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。2 初发酵实验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），361 培养24 h2 h，观察倒管内

12、是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。3 复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。 思考题 1 为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？ 2 复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐？表3-2大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MP

13、N100ml（g）95可信限1ml（g）30.1ml（g）30.01ml（g）3下限上限0000000001233030609059000001111012330609012051300000222201236090120160520000003333012390130160190102101111000001234070110150102301111111101237011015019030360111122220123110150200240303601111333301231602002402903036022220000012390140200260103702222111101231502002703403044022222222012321028035042070703904702222333301232903604405301001500333300000123230390640950407015012001300180033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500