中南大学生物科学与技术学院文档格式.docx

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基因诊断临床应用中存在的问题；

几种常见遗传病的基因诊断。

二．讲授重点：

基因诊断的概念、原理及特点；

三．讲授难点：

基因诊断策略；

基因诊断的基本技术及其原理。

四、教学方法：

多媒体教学

五、教具：

多媒体课件

六、讲授内容：

传统医学诊断的缺陷：

根据病人的临床症状和体征进行诊断，准确性较低；

此外，某些疾病（如新型疾病）并无症状可以依据，必需借助于基础医学的实验室诊断技术。

在基因水平诊断疾病

04级临床、口腔医学七年制

4学时

朱敏

湘雅医学院新教学区T111教室

2006年5月23日、5月30日

医学分子生物学（卫生部8年制及7年制规

划教材），冯作化主编，北京：

人民卫生出版社，2005，第一版

第十九章在基因水平诊断疾病

六、讲授内容（同八年制）

现行的实验室诊断技术主要分为三大类：

基于光学显微镜下细胞形态结构的认识，根据疾病所导致细胞形态和（或）数量上的改变提供诊断依据（如镰形红细胞贫血）；

检测疾病所致代谢产物和酶的活性变化，是20世纪50年代形成的第二类实验室诊断技术，如肝功能检查；

第三类为20世纪60年代开始兴起，以免疫学检验技术为主，通过识别特定蛋白质分子的差异，如恶性肿瘤患者的甲胎蛋白异常表达（AFP）。

共同特点都是针对疾病的表型改变建立诊断指标，而表型的改变常常是在疾病的中晚期才出现，在很多情况下也不够特异。

近几十年来医学遗传学和分子生物学的发展，导致对疾病表型和基因型的关系有了较深入的认识：

人体所有疾病都直接或间接地与基因有关，可以是人体自身基因由于结构的变异或其他因素导致基因功能或其表达产物异常，也可能是外源性致病基因在人体内表达形成异常表达产物，因而从基因水平认识、诊断疾病成为可能，其理论和技术已开始建立并迅速发展，新型的疾病基因诊断正在形成之中。

第一节基因诊断的概念及常用技术

定义：

genediagnosis，就是利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。

疾病的基因诊断不仅可以在表型改变以前进行早期诊断，更是对疾病进行本质的诊断，因为它直接以病理基因（致病基因、疾病相关基因和外源性病原生物基因）为分析对象，属于病因学诊断，这是它与传统临床诊断和上述三类实验室诊断的根本区别。

一．基因诊断的方法、原理：

目标核苷酸序列的识别及其定性定量分析是基因诊断的基础

基因诊断建立在分子生物学理论和技术发展的基础之上。

最早应用于基因诊断的方法为Southern印迹杂交及借助限制性内切酶的片段长度多态性分析。

1985年以来，随着PCR技术的建立和发展，一系列建立在PCR基础上的简便、快速、灵敏、可靠的基因诊断技术被广泛应用于多种疾病的诊断。

核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断的基础技术，许多基因诊断技术都是以此为基础发展起来的。

当然，DNA序列测定和近年来发展起来的基因芯片技术也能用于基因诊断，并有其独特的优点。

核酸分子杂交和PCR扩增及其他常用的基因诊断技术：

（一）应用核酸分子杂交可进行基因的特异识别和分析

原理：

核酸变性和复性理论。

双链DNA分子在某些理化因素作用下解旋，条件恢复后又可依碱基配对规律形成螺旋结构。

来源不同、具有互补碱基序列的核酸（DNA或RNA）单链在适宜条件下可按碱基配对规则通过氢键结合在一起形成双链结构，选用已知顺序核酸片段作为探针，标记后与未知核酸链进行杂交反应，分离已杂交和未杂交的标记核酸片段，通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析。

核酸杂交分析的基本过程：

（1）PreparationofSamplesandProbes；

（2）PrehybridizationandHybridization；

（3）DetectionandAnalysisoftheResult

1．制备合适的探针是核酸杂交用于基因诊断的关键：

Whatisaprobe?

DNA,cDNA,RNA,Oligonucleotide

探针由核苷酸链和可示踪的标记物两部分组成。

不同探针在应用中各有特点，但最重要的都是探针序列的选择，合适的探针序列是基因诊断准确、特异、简便、可靠的基础。

2．不同形式的核酸分子杂交可用于不同的诊断目的：

Southernblotvs.Northernblot;

Dothybridizationvs.Reversedothybridization

Southernblot一般过程：

提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离（DNA分子有其独特的限制性酶切图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带）→变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→预杂交及杂交→结果检测与分析

图示：

核酸杂交结果分析

原位杂交（insituhybridization）是细胞学技术与核酸杂交相结合的方法。

特点：

不需分离核酸物质，进行核酸定位分析。

FISH:

fluorescenceinsituhybridization

（第一学时）

（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术

PCR于1985年建立，引发了分子生物学本身发展的革命。

•PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段合成的过程

•理论上，从一个模板分子起始，经过n次聚合反应后可合成2n个分子。

如进行30轮扩增，则可合成出230，即109个待检分子；

对一段500bp的DNA片段来说，约等于1μg。

PCR在基因诊断中的作用：

放大待诊信号，提高检测灵敏度。

从极少样品即有可能扩增出电泳后肉眼可见的产物。

用于临床疾病诊断，可进行已知序列或已知部分序列基因的检测，并可与其他技术方法结合使用，成为多种基因分析方法的基础。

1．直接采用PCR技术进行基因诊断：

依据：

特异性扩增产物的有无

2．采用PCR产物的限制性长度多态性分析进行基因诊断（PCR-RFLP）

RFLP:

RestrictionFragmentLengthPolymorphism

通过PCR将包含待测位点的DNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制性内切酶水解，根据限制性片段数量和长度变化进行判别。

3.采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交进行基因诊断（PCR-ASO，PCR-DB）：

适用于突变位点已知的情况。

ASO:

AlleleSpecificOligonucleotide

针对已知突变分别合成一对寡核苷酸探针，其中一个为野生型，另一个为突变型。

4.通过PCR产物的反向点杂交分析进行基因诊断（PCR-RDB）

RDB:

ReverseDotBlot

5.采用PCR产物的单链构象多态性分析进行基因诊断（PCR-SSCP）

Single-strandConformationPolymorphism

PCR-SSCP分析原理

6.采用PCR结合变性梯度凝胶电泳分析技术进行基因诊断（PCR-DGGE）

DenaturingGradientGelElectrophoresis

7.用甲基化特异性PCR进行基因诊断

MethylationspecificPCR,MS-PCR

模板甲基化处理，C-U

需设计特异性甲基化引物G:

C/A:

U

8.采用PCR技术对靶核酸进行定量分析

Q-PCR,QuantitativePCR

基本原理：

PCR指数扩增规律

N=N0（1+E）n

（1）通过测定PCR产物量对靶核酸进行定量分析

梯度（系列）稀释法

灰度扫描法

PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示的产物量差异

（2）采用极限稀释法对靶核苷酸进行定量分析

基本依据：

PCR扩增的有效起始模板分子数为104～106个

（3）采用非竞争性对照法对靶核酸进行定量分析

同时扩增靶序列和内标序列

如看家基因（housekeeper）用于RT-PCR进行表达分析

（4）采用竞争抑制法对靶核酸定量分析

需制备标准参照核酸

（5）采用荧光标记探针对靶核酸进行定量

分析：

安全、简便快捷、多重检测

real-timePCR进行荧光定量分析的原理

（三）DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术

核酸序列分析即测定核酸一级组成核苷酸排列顺序。

四色荧光自动测序结果

（四）DNA芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术（DNAchips）

生物芯片（biochip&

bioarray）技术：

根据生物分子间特异性相互作用，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物成分的高通量快速检测分析。

疾病诊断芯片

个性化用药芯片

基因芯片杂交结果

二.基因诊断有其独特的优点

•高特异性：

诊断目标

•高灵敏度：

分子生物学方法

•结果稳定可靠：

核酸的化学本质

•早期诊断性：

分子遗传学规律

•应用广泛性：

疾病与非疾病检查

（第二学时）

第二节对不同的疾病需要采取不同的基因诊断策略

由于疾病在分子发病机制水平上不同，诊断策略各不相同。

一．通过致病基因的检测诊断疾病

必需条件：

疾病与特定基因或蛋白质功能异常关联；

基因已被克隆，结构已知；

致病性基因突变及其致病分子机制已基本清楚。

二．通过连锁遗传标志检测诊断疾病

基因未被克隆；

基因结构不清楚等导致不能通过直接的基因结构分析进行诊断，但可检测与特定染色体位点连锁的遗传标记进行基因诊断。

同一染色体上位置靠近的相邻基因或其他遗传标志（如限制性内切酶位点）在遗传过程中分离的几率很低，常共同遗传，形成连锁关系。

三．通过表型克隆建立疾病基因诊断指标

将多基因、多因素疾病的有关表型与基因结构结合起来，直接分离与表型相关的基因。

通过分析正、异常基因组的相同或差异，找到正常人和疾病患者之间的差异序列，进而分离、鉴定与疾病相关的多个基因，确定导致疾病的分子缺陷。

四．通过基因表达的定量分析诊断疾病

受机体内外因素的影响，基因表达水平发生异常变化时导致蛋白质功能紊乱或疾病发生，分析相关基因mRNA水平。

第三节基因诊断为医学的发展开辟广阔前景

一．基因诊断经历了三个基本发展阶段：

1.杂交基础上的RFLP分析；

2.PCR及其衍生技术

3.芯片阵列杂交

二．基因诊断的问题

（一）基因诊断技术的应用存在理论问题

（二）技术问题

（三）伦理问题

三．However,genediagnosisisapromisingmethodfordiseasediagnosis

基因诊断有巨大的发展前景。

第四节用基因诊断技术检测遗传病

基因诊断技术途径：

•①直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接诊断途径；

•②利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的间接诊断途径。

一．直接诊断：

检测已知致病基因，其必要条件

①被检基因的突变类型与疾病发病有直接的因果关系：

②被检基因的正常分子结构已被确定；

③被检基因突变位点固定而且已知。

1.点突变：

（1）导致特异性限制性内切酶位点改变

镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变

Beta株蛋白生成障碍性贫血-Beta株蛋白基因突变

（2）无限制性酶切位点改变

PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交及等位基因特异PCR（allelespecificPCR，AS-PCR）或称为等位基因特异性扩增（ASA）等技术。

PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变。

反向斑点杂交示意

2.基因重排：

核酸分子探针杂交与PCR

在DNA序列上有较长一段序列的重新排布。

包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。

（1）Southern印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号

（2）多重PCR，1988年Chamberlain等采用多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因的多个基因座。

3.基因表达异常

•mRNA的相对定量分析

•mRNA的绝对定量分析

•mRNA长度分析

RT-PCR原理示意

实时荧光定量PCR分析

二．间接诊断：

检测与致病基因连锁的遗传标志

DNA多态性：

指群体中的DNA分子存在至少两种不同的表型或基因型，即个体间同一染色体的相同位置上DNA核苷酸序列存在一定的差异或变异。

•多态性在人群中出现的频率应大于1%（如小于1%常认为是异常突变）。

•在生物进化过程中形成的，它本身并不致病或于遗传病有直接联系，故称为“中性突变”。

•人类的23对染色体中，每一条上都带有许多遗传多态性位点，其中一些位点在染色体上的位置与致病基因靠的很近，甚至连锁在一起遗传，并且呈孟德尔式遗传。

因此，可利用这一多态性位点作为遗传指示标记。

三代遗传标志：

1.RFLP

2.STR（shorttandemrepeats）,

VNTR（variablenumberoftandemrepeats）

3.SNP（singlenucleotidepolymorphism）

镰状红细胞贫血HBS的连锁诊断

DNA指纹分析用于亲子鉴定

（第三学时）

三．几种遗传病的发病机制及适用诊断技术

（一）血红蛋白病

（二）杜氏肌营养不良症

（三）苯丙酮尿症

（四）脆性X综合征

第五节肿瘤的基因诊断

降低恶性肿瘤危害性的关键是预防、早期诊断和早期治疗。

肿瘤的防治困难的主要原因之一是早期诊断存在问题，到医院确诊的癌症患者大多数已发展至中晚期，多数患者已有远处转移。

1．肿瘤基因诊断策略

2．肿瘤染色体异位及融合基因

3．癌基因和抑癌基因

4．肿瘤相关病毒

5．肿瘤标志物基因

第六节感染性疾病的基因诊断

1．特点

2．病毒感染性疾病

3．细菌感染性疾病

4．寄生虫感染性疾病

小结

基因诊断利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态，对疾病作出诊断，具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、应用范围广、适用性强和简便快捷等特点。

其基本技术是核酸分子杂交和PCR扩增。

核酸分子杂交可分为Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交、原位杂交等。

以PCR技术为基础，建立了一系列基因诊断技术，包括PCR产物的限制性片段长度多态性分析、PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交、PCR产物的反向斑点杂交、PCR-SSCP分析、PCR-DGGE分析、Q-PCR等及DNA序列测定和基因芯片等技术。

基因诊断的基本策略包括直接检测疾病基因、间接检测连锁遗传标记、建立疾病表型相关系列基因克隆和特定基因表达的定量分析等。

尽管基因诊断在理论、技术和伦理上都还存在一些问题，但它仍然具有巨大应用前景。

七、思考题：

1.什么是基因诊断？

它具有那些突出优势？

2.简述目前常用的基因诊断基本策略。

3．列举4种常用的基因诊断方法并说明其工作原理。

4.通过连锁遗传标志的检测进行基因诊断的依据是什么？

八、参考文献：

1.RobertF.Weaver编著.《MolecularBiology》（第二版）.北京：

科学出版社.2002

2．LelandH.Hartwell等编著.《Genetics:

fromgenestogenomes》.北京：

科学出版社.2003

3.SambrookandRuussell编著.《MolecularCloning》（第三版）.西安：

世界图书出版公司.2002

4.胡维新主编.《医学分子生物学》长沙：

中南大学出版社.2001

5．TimothyM.Cox&

JohnSinclair编著.《MedicineMolecularBiology》.北京：

科学出版社.2000

6．冯作化主编.《医学分子生物学》.北京:

人民卫生出版社.2001