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又由于痛觉是意识水平的感觉,我们无法确定动物是否具有痛觉,只能观察其对伤害性刺激的行为反应。

因而在下文的描述中有时用伤害性感受阈(nociceptivethreshold)取代痛阈(painthreshold)。

正常情况下,疼痛是机体对外界伤害性刺激的感受,它是一种报警系统,提示实存的或潜在的组织损伤的可能性。

如果这种伤害性刺激是可以回避的,那么痛觉就是一种具有完全的积极意义的感觉形式,称为生理痛。

这种意义上的疼痛模型实际上就是对伤害性感受阈的测量。

它是通过观察动物对伤害性温度和机械刺激的逃避反应实现的。

如果动物遇到无法逃避的伤害性刺激,就会引起它的情绪反应,发出嘶叫声。

这是需要高级神经中枢配合的反应,并且不受局部运动功能的影响。

因而,在伤害性刺激下引起的嘶叫反应也可以作为伤害性感受阈的测量指标。

热辐射-逃避法

这是最常见的伤害性感受阈测量方式。

最常用的有热辐射-甩尾法、热辐射-甩头法和热辐射-抬足法。

热辐射-甩尾法

以大鼠为例。

先将大鼠固定在特制的塑料筒中,令其尾部暴露在外并自然下垂,待动物安静20分钟后再予测定。

辐射热源可采用8.75毫米放映灯泡(电压为18.5伏,可调节),经透镜聚焦后发射出直径约4毫米的光束,照射相当于尾部中、下三分之一交界处的皮肤(光源与尾部皮肤必须紧密相贴);

采用与光源并联的电子计时器同步记录照射持续时间,即当照射开始同时启动秒表,当动物尾部出现明显逃避应时,关闭光源并同时停止计时。

所测得的时间间隔即为甩尾反应潜伏期(Tail-FlickLatency,TFL)。

一般在正式测量之前先调节电压,使TFL值保持在4~6秒左右,然后每5分钟测定一次,取三次测定的平均值作为基础伤害性感受阈。

若动物在镇痛作用下TFL延长至超过15秒,则停止照射并以15秒作为甩尾潜伏期的上限,以免照射过久灼伤皮肤。

用类似的方法也可以在小鼠测定其热辐射-甩尾反应潜伏期。

热辐射-甩头法

一般用家兔作为实验对象。

先将家兔用特制的布带悬空吊起,令其四肢自由伸展,并蒙蔽其眼睛。

实验前应用弯剪刀小心剪去口唇部胡须。

待动物安静后,用上述同样的光源照射家兔口唇,等待其明显的逃避反应(将头部移开)。

利用同样的电子计时器测定此反应的潜伏期。

计算方法如上所述。

注意其最长照射时间不要超过10秒。

热辐射-抬足法

仍以大鼠为例,将大鼠固定在特制塑料筒中,令其后肢暴露在外。

待动物安静后,用同样的辐射光源照射其后足掌底部;

或令大鼠自由站立于玻璃板上,将辐射光源置于玻璃板下,隔玻璃照射足底。

测定其逃避反应(抬足)出现的潜伏期。

以15秒为其最长照射时间的上限。

冷水、热水刺激逃避法

实验动物可以是大鼠或小鼠。

刺激部位可以选择尾尖或后足。

将动物适当固定后,令尾尖或后足自然下垂。

待动物安静后,将被刺激部位浸于10°

C的冷水或46°

C的热水中,记录从开始浸入到被刺激部位逃离水面或出现明显挣扎行为的时间作为伤害性感受阈。

仍以15秒为最长刺激时间的上限。

机械刺激-逃避法

又称为Randall-Selitto反应。

一般选用大鼠作为实验动物。

动物置于特制塑料固定筒内,用Randall-Selitto反应测定仪给鼠后足跖部施加以恒定速率连续递增的压力。

当其后足缩回时,即停止加压并读出此时之压力数值(mmHg),以此压力-缩腿阈(Paw-WithdrawalThreshold,PWT)作为伤害性感受阈。

先测定三次PWT,每次测定间隔5min,取其平均值作为基础阈值;

以后测定所得结果均与它比较,并以150%作为PWT升高的上限以免损伤局部组织。

另一种方法是,每次给动物足底施加恒定的压力,记录从开始加压至动物做出逃避反应的时间,以此时间作为伤害性感受阈。

机械刺激-嘶叫法

此方法一般以大鼠为实验对象。

采用的固定方法与前节相同,但给予动物不可逃避的刺激,记录动物发出嘶叫时的压力数值(当采用连续递增的压力时)或时间潜伏期(当采用恒定压力时)。

电刺激-嘶叫法

本法同样以大鼠为实验对象。

刺激部位可以是尾部或后足。

首先将动物适当固定,并将一对不锈钢针刺激电极插入待测部位(两极间距1cm),待动物安静后给刺激电极通以频率为50Hz的方波刺激,逐渐增大电流强度,记录动物开始发出嘶叫时的刺激强度,作为其伤害性感受阈。

急性病理性疼痛模型

当疼痛并非由外部环境原因所致时,疼痛感觉将持续而无法逃避,此时的疼痛就属于病理性疼痛范围。

病理性疼痛按其病程可分为急性和慢性两大类。

前者多由确定的损伤或炎症反应所致,当损伤痊愈或炎症消失时,疼痛即可消除。

后者则多由难以消除的慢性炎症或神经病变所致,病程常迁延很久。

本节将介绍三种急性病理性疼痛模型:

模拟腹腔炎症的扭体模型、模拟躯体炎症的福尔马林致痛模型和白陶土-鹿角菜胶炎症模型。

扭体模型

本模型可采用小鼠或大鼠。

有多种刺激物都可诱发动物扭体(writhing)行为。

最常见的刺激物是醋酸(aceticacid)。

将1克阿拉伯胶(arabicgum)加入9ml浓度为1%的醋酸溶液中,再注入实验动物体内,观察注射后90分钟期间每15分钟内出现典型扭体症状的次数。

该模型可以模拟腹腔炎症引起的腹痛症状,常用于镇痛药物的筛选。

即观察药物处理组与安慰剂组扭体症状的差别,以确定该药物是否具有镇痛效应以及其剂量-效应曲线。

福尔马林致痛模型

本模型的目的是模拟急性组织损伤所致的持续性疼痛。

一般以大鼠为实验对象。

在动物一肢足背皮下注射稀释的福尔马林(formalin)溶液,导致动物的行为改变如安静时的屈腿、运动时的跛行以及舔足等。

这些行为的程度(如舔足时间)与福尔马林浓度成正比,一般认为它是疼痛的象征。

此外,其它行为如理毛、探索和运动活动等也受福尔马林注射的影响。

具体做法如下:

将实验动物随机分为若干组,其中福尔马林组在一肢足背皮下注射稀释的福尔马林溶液50ml,浓度在0.1%~10%之间。

对照组动物将注射针刺入同部位注射等体积的生理盐水。

注射后,将动物置于观察笼中,在动物不能察觉的前提下记录其在60分钟内对注射侧和对侧后足的舔足时间。

每隔5分钟计算一次舔足分数(即总舔足时间)。

另外一种评分方法是,按如下的四级评分:

0=注射足承担正常重量;

1=运动时跛行、休息时足轻触地面;

2=注射足抬高,最多用指甲触地;

3=出现针对注射足的舔、咬和理毛行为。

必须注意的是,动物应事先训练10天使之适应实验室的环境及手捉等处理。

动物应饲养在恒定的昼夜节律(光照时间)环境中,且观察应当在“暗夜期”在暗红色光线下进行。

本模型的各种症状普遍分为两个时相:

前5分钟为第一相,20~60分钟为第二相。

两相均可用于实验,但以第二相为常用。

据认为,使用1.5%的福尔马林剂量加上综合的评分方法具有最强的分辨痛程度的能力。

Clavelou等人新近提出了一种用于面部的福尔马林致痛模型。

他们把不同浓度的福尔马林溶液(0.2~10%)皮下注射到大鼠的右上唇,对照动物则注射盐水。

注射后,立即把动物放在观察箱中观察45分钟。

记录注射后每3分钟时间内动物用同侧前肢或后肢摩擦注射部位的秒数作为痛分数。

注射后动物呈现出类似的两相痛敏。

结果表明浓度在0.5~2.5%之间的福尔马林溶液最有利于观察疼痛强度的变化情况。

白陶土-鹿角菜胶炎症模型

本模型的目的是模拟亚急性炎症所引起的疼痛。

白陶土(Kaolin)是一种细颗粒状物质,成分为氧化铝,在此起机械刺激作用;

鹿角菜胶(carrageenan)是由水生植物鹿角菜中提取的胶体物质,具有过敏刺激作用。

鹿角菜胶单独实验即可诱发炎症,若与白陶土合并使用,则炎症更为强烈。

可采用家兔或大鼠作为实验对象。

今以大鼠为例。

关节炎的引发分为两步:

首先将动物麻醉(可用戊巴比妥钠或水合氯醛),由一侧后肢足底注入4%白陶土混悬液0.1ml,并按摩5分钟使之在组织中分散。

在第一次注射的1小时后,再注入2%鹿角菜胶溶液0.05ml并按摩5分钟。

以第一次注射的时间作为致炎开始时间。

炎症过程一般在第一次注射后2小时内开始。

动物后足明显红肿,皮温显着升高,PWT值显着降低,呈现类似痛敏的症状。

这些症状一般能持续至第一次注射后12小时以上,24小时后基本复原。

因而本模型属于亚急性炎症痛模型范围。

本模型亦可采用关节腔注射。

此模型适合进行急性药理实验以及比较炎症发作前后变化的电生理实验。

慢性病理性疼痛模型

临床上持续超过6个月的疼痛即被视为慢性痛。

慢性病理性痛的特征是,疼痛持续时间长,一般均涉及机体的系统性病变(如免疫反应异常或神经系统的异常)。

其疼痛没有明显的外界刺激作为诱因或疼痛程度与局部的病变之严重性不成比例。

在这个意义上,癌症痛不属于慢性痛,因为它具有明确的局部持续刺激,应当属于急性痛的持续状态。

慢性病理性疼痛模型主要分为两大类型:

炎症性及神经源性。

炎症痛模型

炎症是疼痛最常见的原因。

很多原因不明的疼痛疾患实际上是由于软组织的无菌性炎症所致。

因而,在动物模型上研究炎症痛的特征、机制,可能为理解疼痛及寻找有效的镇痛方法提供帮助

我们介绍3种慢性炎症痛模型,均是以福氏佐剂作为致炎物质的。

它们是:

多发性佐剂关节炎,单发性佐剂关节周围炎和单发性佐剂关节腔炎模型。

多发性佐剂关节炎模型

本模型系采用每毫升含干重为1毫克结核杆菌的高浓度福氏佐剂,向大鼠尾根部或足底作皮内注射。

溶剂采用4份石蜡油、4份生理盐水和1份乳化剂(Falba或AracelA)混和而成。

注射后77~90%的大鼠会出现一定的持续时间不等的关节炎症。

动物的一侧或双侧后肢通常首先出现改变,出现多个关节的红肿;

其次是前肢和尾部出现关节炎症。

根据动物受累及的关节数目及其行为表现,可以对此炎症的严重程度予以评价。

多数动物在第18~25天内病情最为严重。

福氏佐剂是一种免疫佐剂,可以加强机体对抗原产生免疫的能力。

本模型所诱导的是动物的免疫反应性炎症,其目的是模拟某些自身免疫性疾病如风湿性关节炎。

多发性佐剂关节炎是最早提出的关节炎模型之一。

利用此模型曾经做了大量工作。

这一模型适合于进行抗类风湿的药物研究和自身免疫性疾病的研究。

用于作为疼痛模型时,其缺点是病变范围过于广泛,除了多个关节均有炎症反应以外,往往伴随有机体多个器官系统(包括中枢神经系统)的免疫性病变。

这一情况限制了它在疼痛研究特别是疼痛的中枢神经机制研究中的广泛应用。

单发性佐剂关节周围炎模型

为了避免上述模型的缺点,同时又要利用佐剂造成慢性的炎症反应,人们采用了单发关节炎周围炎模型。

其制作方法是:

把0.15ml完全福氏佐剂(内含0.1%灭活结核杆菌)注射到动物后肢足底,造成关节周围局部组织的炎症反应。

该模型的技术要点是:

佐剂应注射至皮下而非皮内,注射后要按住针孔按摩数分钟以促进药物扩散。

注射1天后,局部即呈现明显的红肿、自我保护和运动障碍现象。

本模型病程约为7周。

局部在第1周内对辐射热呈现痛敏,第1~3周内对机械压力呈现痛敏。

其局部肿胀需要6~7周才能完全恢复。

除利用上述方法测量伤害性感受过敏情况以外,还可以评定其关节的运动情况。

包括下述三项内容:

(1)运动状态评分;

(2)站立姿态评分;

(3)肢体僵硬状态评分。

具体评分标准如表50-1。

本模型避免了多发性关节炎的病变过广和发病率不高的缺点。

但它本身也存在一些不足:

首先,本模型痛敏持续时间较短,只有1~3周;

其次,尽管模型动物表现出明显的自我保护行为(痛敏存在的标志),但其机械和热痛敏却不易引出。

单发性佐剂关节腔炎模型

表50-1动物后肢运动、站立及肌僵评分法

评价标准

分数

运动评分

动物只能躺着

动物只能爬行

1

动物可行走,但较困难

2

动物可行走或快跑,但较困难

3

动物可正常行走或快跑

4

站立评分

动物只能三足站立

动物关节炎足可触地,但足趾蜷曲

动物关节炎足可支持部分体重

动物四肢平等支持体重

肢体僵硬评分(每足最大分值为2分)

肢体伸展受限

肢体屈曲受限

为了解决前述模型存在的问题,本模型将高浓度的福氏佐剂(含有300mg结核菌素)直接注射到大鼠后肢踝关节腔中(注射体积为0.05ml),从而导致一个具有急性、慢性两相的高度局限的关节炎症。

具体制作方法如下:

将50毫克灭活结核菌素加入由6ml石蜡油、4ml生理盐水和1ml吐温80组成的混和物中,充分混和并在120°

C下高压处理20分钟。

然后冷藏保存,至使用前加温并彻底混和。

注射时,在麻醉下将动物后肢踝关节伸展,在外踝后的凹陷处刺入注射针头,然后转向足趾方向,在胫骨、腓骨和距骨之间的缝隙处刺入踝关节囊。

刺入大约3mm时可体会到落空感,此时推注福氏佐剂。

若确实刺入关节囊,则在推注0.05ml之后将感到极强的阻力。

该模型在注射后第1周内出现急性炎症,以红肿、体重增长减慢、直立行为减少和运动减弱为特征;

第3周开始出现慢性炎症。

痛行为表现为探索和直立行为显着减少,PWT显着降低而呈现痛敏状态,运动减弱现象也进一步加重。

此时屈、伸关节评分(将动物肢体作被动屈伸,屈曲时出现缩腿反应为1分,出现嘶叫也为1分,共2分,反复5次计算总分;

伸展时亦做同样评分)也显着增高,提示存在明显的痛敏。

小结

如上所述,在三类关节炎模型中,多发佐剂性关节炎的发病率较低,动物全身病变较为严重,且常涉及其它系统尤其是中枢神经系统的病变,对于神经系统功能研究会有一定程度的影响。

这种模型也常受到国际动物保护组织的批评。

单发性关节周围炎模型制作简单,发病局限,但炎症持续时间较短,可用于短期疼痛的神经机制研究,但作为长期的慢性痛模型并不适当。

单发佐剂性关节腔炎模型持续时间长,其临床症状比较易于定量研究,且发病只局限于关节局部,是一种进行长期慢性炎症痛状态下神经系统功能改变的理想模型。

神经痛模型

神经源性痛指由外伤或疾患导致的外周神经、脊髓背根、脊髓或脑内某些区域的病损所致的疼痛。

它具有几种不同类型的特征性异常痛感觉。

自发痛最为常见,可能是持续的表面灼痛,或深部的酸痛;

也可表现为电击样的发作性痛。

患者常表现为对热、冷及机械刺激的痛敏和痛觉异常(指将通常的非痛刺激感受为疼痛)。

神经源性痛的机理不明,临床治疗效果也常不令人满意。

由于临床症状的千变万化,对神经源性痛进行临床研究是很困难的。

因此,在实验动物身上重现这种状况对于有关研究具有重要意义。

人们已经制备了几种有关的动物模型,可以很好地模拟几种神经源性痛。

中枢神经系统损伤性神经源性痛模型

在人类,脑和脊髓某些部位的损伤可导致中枢性疼痛。

现在已知所谓“丘脑痛”是由于丘脑、脑干或皮层损伤(一般是由于脑血管意外)造成的;

但在动物模型中类似情况的研究相对较少。

脊髓损伤也可以导致严重的神经源性痛。

目前有两种有关的大鼠模型。

应用得最多的是Hao等提出的光化学损伤模型。

动物在麻醉下做一侧颈静脉插管。

然后在背部中线切开皮肤,暴露T8-T12节段的椎体。

将ErythrosinB染料溶解在生理盐水中作静脉注射,在5分钟内达到32.5mg/kg体重的剂量。

注射后,动物立即置于波长为514.5nm的氩离子激光照射之下,将刀口形激光束对准T10节段椎体(相当与脊髓T11~12)照射1、5或10分钟。

所用的激光为平均功率0.16瓦,频率500赫兹的脉动激光(最大锋功率2.4瓦)。

为避免组织过热,用最大风速为6米/秒的电风扇尽可能靠近脊柱(距离约5mm)开动。

照射期间用加热板将动物体温控制在37至38°

C之间。

此处理可导致血管内的光化学反应,导致脊髓缺血性损伤。

照射之后动物出现明显的异常痛觉,轻触即可导致动物嘶叫,轻刷体侧即可引起明显激惹。

在此期间用vonFrey毛所引出的机械压力嘶叫阈明显降低,部分动物还出现自发嘶叫。

这种异常痛觉可持续数小时至数日。

异常痛觉的程度及持续时间与照射时间没有明显关系。

而且尽管照射1分钟并无可见的脊髓损伤,异常痛觉仍旧出现。

该模型的异常痛觉在照射后4小时可为2mg/kg吗啡所消除(与假手术动物的一过性异常痛觉现象相同),但24~48小时之后即使用较大剂量吗啡(5mg/kg)亦无法消除异常痛觉。

由于中枢痛敏及中枢损伤过程一般被认为有兴奋性氨基酸参与,Yezierski和Park近来提出了另一个中枢神经损伤模型。

他们在大鼠下位胸髓和上位腰髓内注射海人酸(quisqualicacid,QA,剂量为0.3~1.5ml,8.3~125mM),在此后7~36天内动物腰2~5节段内的神经元对机械刺激及可兴奋A和C纤维的坐骨神经电刺激的反映均明显加强,提示这种处理也可以作为一种疼痛模型。

疾病导致的周围神经性疼痛模型

最常见的周围神经损伤性神经源性痛是由两种疾病引起的,即带状疱疹和糖尿病。

带状疱疹可引起严重的疼痛,但大多数患者在皮疹消失后疼痛亦消失。

仅在少数病例特别是老年人中,疼痛可在皮疹痊愈之后持续数月、数年甚至几十年。

这种疱疹后神经痛的发病率随着人类寿命的延长而日趋增加,但目前尚无法制备类似的动物模型。

相反地,啮齿类动物的糖尿病模型很容易制备。

Courteix等人用大鼠制备了具有慢性痛行为的糖尿病模型。

他们将streptozocin溶解在蒸馏水中给大鼠腹腔注射,剂量为75mg/kg;

对照动物只注射蒸馏水。

一周后测量尾静脉血糖水平,只有最终血糖高于14mM的动物才被认为是合格的糖尿病动物。

动物在注射一周后血糖开始明显升高,体重增长明显减慢,在冷、热水浸尾、压力-缩腿反应和福尔马林测痛实验中均表现为痛敏。

此模型的痛敏和糖尿病临床症状同时出现,因而为人类糖尿病性神经痛的研究提供了可能性。

外伤导致的周围神经性疼痛模型

首先应指出的模型是Wall等人的“神经瘤”模型。

大鼠或小鼠在麻醉和无菌操作下,在股段中部切断后肢坐骨神经,然后缝合肌肉和皮肤,并给予一定量的抗菌素以消除术后感染。

术后动物饲养在正常的昼夜节律光照下,可存活一年以上。

术后定期观察动物的自残行为。

自残一般从咬趾甲开始,逐步向前发展。

有些动物可以咬到踝关节附近。

评分方法:

若有一个或以上的趾甲被咬掉则给1分(由于趾甲不断增长,这种现象可能有时出现,有时又消失);

每有一节足趾的远端被咬掉再加1分;

每有一节足趾的近端被咬掉再加1分。

因而,若所有的趾甲和所有足趾的每一部分都被咬掉,动物将得到11分。

当动物得到11分时,即处死动物。

一般术后一周内即出现少量自残现象,10周后平均自残可达4分。

其次是Bennett和Xie提出的“坐骨神经部分结扎”模型。

大鼠麻醉后,在股段中部切开皮肤和肌肉,暴露坐骨神经干。

将约7厘米的神经游离出来,并用4.0号铬制肠线在其上作4道较松的结扎,结扎间距约1厘米。

因而受损神经长度约为4~5厘米。

结扎程度以在40倍放大镜下观察有形变但不影响神经被膜表明的血管流通为准,有时可见暴露区周围肌肉的短暂收缩。

结扎后按层缝合。

对侧坐骨神经也同样暴露但不予结扎。

术后1周到10天,动物即出现明显的热痛敏,而且动物后肢出现异常痛觉现象,患肢不敢触地,对寒冷刺激也更加敏感。

Seltzer等人提出了另一个“坐骨神经半结扎”模型。

大鼠在麻醉及无菌操作下在股段高位暴露右侧坐骨神经。

在25倍放大镜下,在坐骨神经干向后二头肌和半腱肌分支处的远端小心地将神经背侧与周围组织分离开来,用小止血钳夹住神经背侧(注意勿将神经挤压在其下的组织上),将一条8-0号硅制丝线缝入神经干内,使神经的背侧3/1~2/1被收在线套内。

然后扎紧线套。

肌肉和皮肤均用棉线缝合。

假手术组只作切开暴露和缝合。

从术后数小时起直到此后数月之内,动物均表现出明显的同侧后肢保护行为和舔足行为的增加,提示自发痛的存在。

足底区域对伤害性及非伤害性刺激表现出同等的过敏现象,但无自残现象出现。

动物还表现出对触觉的异常痛感觉和对激光脉冲热刺激缩腿阈的双侧降低,但只有同侧对阈上刺激表现出过度的反应,提示热痛敏现象的存在。

对锐利性压迫机械刺激的痛敏则双侧均存在。

据认为,该模型的痛敏现象与交感神经传出的关系极为密切。

冷冻镇痛是一种临床技术,即通过对周围神经的冷冻实现对术后痛或慢性痛的镇痛治疗目的。

有趣的是Deleo等人却利用类似的技术提出了模拟神经源性痛的坐骨神经的冷冻损伤模型(sciaticcryoneurolysis,SCN)。

他们使用温度为-60°

C的冷冻探头按照30/5/30秒的冷冻/解冻/冷冻周期处理坐骨神经干,每一次冷冻都在神经干上形成一个小冰球。

冷冻处理后动物均出现一定程度的自残现象,自手术后第4天开始,至第14天达到高峰。

并且此种自残并未发生在神经功能暂时丧失的冷冻后即刻,而是伴随着感觉功能的恢复而出现,表明这是一种神经源性痛敏的模型。

为解释神经损伤模型的机制,近来Maves等人制作了一种酸性环境神经痛模型。

他们把酸化了的生理盐水(pH=3.5和pH=5)用微动泵持续7天灌流给未加束缚的大鼠坐骨神经,结果作为对照组(灌注正常pH=7生理盐水)的大鼠没有任何痛敏迹象,而酸化生理盐水组大鼠的后足底出现进行性热痛敏,第6天达到最高峰;

其中pH=5组在第12天恢复正常,而pH=3.5组的热痛敏持续15天以上。

这种模型提供了一种简单的模拟神经源性痛的方法。

神经痛是临床上常见的严重而难于治疗的疼痛性疾患。

上述的几种模型分别在一定程度是模拟了相应的临床疼痛疾患。

但也有一些神经痛如疱疹后神经痛、三叉神经痛等,目前尚无法制备相应的动物模型进行研究。

这方面的有关模型还有待于进一步开发。

结语

本章叙述了某些生理性和病理性疼痛动物模型的建立方法。

毫无疑问,动物模型的建立将为相应的疼痛性疾患的诊断和治疗研究提供帮助。

已有的研究结果表明,不同类型的疼痛模型,其中枢过程有很大的差异。

这表明,疼痛可能并非由简单的中枢机制决定;

痛觉调质以及疼痛本身可能涉及若干中枢机制的复杂组合

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