总氮量的测定凯氏MicroKjeldahl定氮法汇总Word下载.docx
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安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。
2、样品处理某一固体样品中的含氮量是用100g该物质（干重）中所含氮的g数来表示（％）。
因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。
一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称人一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。
用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。
每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。
若样品为液体（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。
精确称取0.1g左右的干燥面粉作为本实验的样品。
3、消化取4个100mL凯氏烧瓶或50mL消化管并标号。
各加l颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂（K2S04—CuS04·
5H2O）200mg，消化液5mL。
注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。
在3及4号瓶中各加0，1mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。
每个瓶口放—漏斗，在通风橱内的电炉上消化。
当消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。
待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。
消化完毕，等烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10mL。
（注意慢加，随加随摇）。
冷却后将瓶中溶物倾人50mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并人量瓶。
用水稀释到刻度，混匀备用。
4．蒸馏
（1）蒸馏器的洗涤蒸汽发生器中盛有用几滴硫酸酸化的蒸馏水。
关闭皮管夹，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。
约15分钟后，在冷凝器下端放一个盛有5mL2％硼酸溶液和1—2滴指示剂混合液的锥形瓶。
位置倾斜，冷凝器下端应完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤1—2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。
向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1cm，继续通蒸汽1分钟。
用水冲洗冷凝管口后用手捏紧橡皮管。
此时由于反应室外层蒸汽冷缩，压力减低，反应室内凝结的水可自动吸出进入反应室外层。
最后打开皮管夹，将废水排出。
（2）蒸馏取50mL锥形瓶数个，各加5mL硼酸和1~2滴指示剂，溶液呈紫色，用表面皿覆盖备用。
用吸管取10mL消化液，细心地由蒸馏器小玻杯注入反应室，塞紧棒状玻塞。
将一个含有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下，使冷凝器下端浸没在液体内。
用量筒取30％的氢氧化钠溶液10mL放人小玻璃杯，轻提棒状玻璃塞使之流入反应室（为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢）。
尚未完全流人时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约5mL。
再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流人反应室，一半留在玻璃杯中作水封。
加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧皮管夹，开始蒸馏。
此时锥形瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。
自变色时起记时，蒸馏3—5分钟。
移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管约1cm，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面。
继续蒸馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿覆盖锥形瓶。
蒸馏完毕后，须将反应室洗涤干净。
在小玻璃杯中倒入蒸馏水，待蒸汽很足、反应室外层温度很高时，一手轻提棒状玻璃塞使冷水流人反应室，同时立即用另一只手捏紧橡皮管，则反应室外层内蒸汽冷缩，可将反应室中残液自动吸出，再用蒸馏水自玻璃杯倒人反应室，重复上述操作。
如此冲洗几次后，将皮管夹打开，将反应室外层中废液排出。
再继续下一个蒸馏操作。
待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。
（3）滴定全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。
（4）计算
总氮量=C（V1-V2）×
0.014/w×
消化液量（ml）/滴定消耗用液量（ml）
c为标准盐酸溶液摩尔浓度；
V1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；
V2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数；
w为样品重量（g）。
14为氮的相对量子质量。
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，
样品中蛋白质含量（％）二总氮量×
6．25
若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。
蛋白氮=总氮—非蛋白氮
蛋白质含量（g％）二蛋白氮×
6.25
改进型凯氏定氮仪
改进型凯氏定氮装置是在传统凯氏定氮装置的结构基础上改装而成，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。
1．改进型凯氏蒸馏装置的结构。
可分成3部分来叙述：
（1）水蒸汽发生器和反应室
（2）冷凝器和通气室
（3）排水柱
2、样品处理
3、消化
4、蒸馏
（1）蒸馏器的洗涤接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水（以排水口高度为宜）用酒精灯将其加热烧开。
然后将蒸馏水由加样室加入反应室，水即自动吸出，或者将酒精灯移开片刻，或者打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器，都可使反应室中的水自动吸出，如此反复清洗3-5次。
清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示剂的混合液。
蒸馏数分钟后，观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。
（2）蒸馏取50mL锥形瓶数个，各加入5mL2％硼酸溶液和1—2滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。
关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。
将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。
用移液管取5mL消化液，细心地由加样室下端加入反应室，随后将已准备好的30％NaOH溶液5mL加入，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。
关闭自由夹打开冷凝水（注意不要过快过猛，以免水溢出）。
当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时（约2—3分钟），开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。
蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。
打开自由夹，将水放出，再加热，再清洗，如此3～5次。
最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉。
关闭夹子，再使蒸汽通过整个装置数分钟后，继续下一次蒸馏。
待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。
（3）滴定
思考题
1、何谓消化？
如何判断消化终点？
2、在实验中加入粉末硫酸钾—硫酸铜混合物的作用是什么？
3、固体样品为什么要烘干？
4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？
5、如何证明蒸馏器洗涤干净？
6、本实验应如何避免误差？
实验二氨基酸的分离鉴定
——纸层析法
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：
Rf=原点到层析中心的距离/原点到容剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、器材
1、层析缸2、毛细管3、喷雾器4、培养皿5、层析滤纸（新华一号）
四、试剂
1、扩展剂650mL
是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。
将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放人分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。
取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。
2、氨基酸溶液0．5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0．5％）。
各5mL
3、显色剂50～lOOmL0．1％水合茚三酮正丁醇溶液。
五、操作
1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2、取层析滤纸（长22cm、宽14cm）一张。
在纸的一端距边缘2～3cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号。
3、点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。
每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm。
4、扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。
将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。
待溶剂上升15—20cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
5、显色用喷雾器均匀喷上0。
1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。
6、计算各种氨基酸的Rf值。
思考题
1、何谓纸层析法?
2、何谓及f值?
影响只f值的主要因素是什么?
3、怎样制备扩展剂?
4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么?
实验三蛋白质的性质实验
（一）
蛋白质及氨基酸的呈色反应
1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、呈色反应
（一）双缩脲反应
1、原理
尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
反应式如下：
双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。
含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2——CH2OH或CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。
NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。
因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2．试剂
（1）尿素
（2）10%氢氧化钠溶液
（3）1%硫酸铜溶液
（4）2%卵清蛋白溶液
3．操作
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后，加10%氢氧化化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，
再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。
观察紫玫瑰色的出现。
（二）茚三酮反应
1．原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。
尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。
因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。
在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1:
1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成型茚三酮；
第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
（1）蛋白质溶液100ml
2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：
水=1：
9）
（2）0.5%甘氨酸溶液
（3）0.1%茚三酮水溶液
（4）0.1%茚三酮-乙醇溶液
3、操作
（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫色再变蓝。
（2）在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
（三）黄色反应
含有苯环结构的氨基酸，如酷氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
2、试剂
（1）鸡蛋清溶液100ml
将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：
20混匀，然后用6层纱布过滤。
（2）大豆提取液100ml
（3）头发
（4）指甲
（5）0.5%苯酚溶液50ml
（6）浓硝酸200ml
（7）0.3%色氨酸溶液10ml
（8）0.3%酪氨酸溶液10ml
（9）10%氢氧化钠溶液100ml
向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。
待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
管号
1
2
3
4
5
6
7
材料
（滴）
鸡蛋清
溶液
大豆
提取液
指甲
少许
头发
0.5%
苯酚
0.3%
色氨酸
酪氨酸
浓硝酸/（滴）
40
现象
（四）考马斯亮蓝反应
考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离存在呈棕红色；
当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。
它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。
反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。
在0.01~1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。
所以常用来测定蛋白质含量。
（1）蛋白质溶液（鸡蛋清：
20）5ml
（2）考马斯亮蓝染液300ml
考马斯亮蓝G250100g溶于50ml95%乙醇中，加100ml85%磷酸混匀，配成原液。
临用前取原液15ml，加蒸馏水至100ml，用粗滤纸过滤后，最终浓度为0.01%。
取2支试管，按下表操作
试剂
管号
蛋白质溶液
（ml）
蒸馏水
考马斯蓝染液
0.1
0.9
通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？
它们的原理？
实验总结
解释现象
尿素结晶
卵清蛋白溶液
甘氨酸溶液
滤纸
现象
解释
现象
实验四蛋白质的性质实验
（二）
蛋白质的等电点测定和沉淀反应
一、蛋白质等电点的测定
1、目的
（1）了解蛋白质的两性解离性质。
（2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。
2、原理
蛋白质是两性电解质。
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液PH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其特异的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
3．器材
（1）水浴锅
（2）温度计（3）200mL锥形瓶（4）100mL容量瓶
（5）吸管（6）试管（7）试管架（8）乳钵
4．试剂
（1）0．4％酪蛋白醋酸钠溶液200mL
取0．4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移人200mL锥形瓶内，用少量40—50C的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移人锥形瓶内。
加入10mL1mol／L醋酸钠溶液。
把锥形瓶放到50C水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移至100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
（2）1.00mol／L醋酸溶液100mL
（3）0.10mol／L醋酸溶液l00mL
（4）0.01mol／L醋酸溶液50mL
5．操作
（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
试管号
0.01mol/L醋酸
1.0mol/L醋酸
8.4
0.6
—
8.7
0.3
8.0
1.0
7.4
1.6
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀——管。
此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。
观察其混浊度。
静置10分钟后，再观察其混浊度。
最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
二、蛋白质的沉淀及变性
（1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
（2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
（3）了解蛋白质变性与沉淀的关系。
2．原理
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。
因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
3．试剂与材料
（1）蛋白质溶液500mL
5％卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：
水=l：
（2）pH4．7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液100mL
（3）3％硝酸银溶液10mL
（4）5％三氯乙酸溶液50mL
（5）95％乙醇250mL
（6）饱和硫酸铵溶液250mL
（7）硫酸铵结晶粉末1000g
（8）0．1mol／L盐酸溶液300mL
（9）0．1mol／L氢氧化钠溶液100mL
（10）0．05mol／L碳酸钠溶液100mL
（11）0．1mol／L醋酸溶液100mL
（12）甲基红溶液20mL
（13）2％氯化钡溶液150mL
4．操作
（1）蛋白质的盐析无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。
盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。
如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
加5％卵清蛋白溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液!
混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。
倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么?
将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。
取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
（2）重金属离子沉淀蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3％硝酸银溶液1—2滴，振荡试管，有沉淀产生。
放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解?
为什么?
（3）某些有机酸沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入1mL5％三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。
放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
（4）有机溶剂沉淀蛋白质取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95％乙醇。
混匀，观察沉淀的生成。
（5）乙醇引起的变性与沉淀取3支试管，编号。
依下表顺序加入试剂：
试剂（ml）
5%卵清
蛋白溶液
0.1mol/L氢氧化钠溶液
0.1mol/L盐酸溶液
95%乙醇
PH4
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