1双抗体夹心法Word下载.docx

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⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物.洗涤除去未联合酶标抗体.

⑷加底物显色.固相上的酶催化底物产生有色产品,经由过程比色,测标本中抗原的量.

现多采取针对单一抗原决议簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体,则受检样品和酶标抗体可一次性参加,简化流程,缩短反响时光.若标本中待测抗原浓渡过高,抗原可分别与酶标抗体和固相抗体联合而不形成上述夹心复合物（相似于免疫沉淀反响中抗原多余时的后带现象）,使最终成果低于现实含量（钩状效应）,甚至消失假阴性现象.是以对此类标本应恰当稀释后再测定.别的,当血清中消失类风湿因子（RF）时,类风湿因子（RF）可充当抗原,而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物,从而消失假阳性成果.

此法是测定抗体最经常运用的办法,属非竞争联合实验.其道理是将抗原衔接到固相载体上,样品中待测抗体与之联合成固相抗原-受检抗体复合物,再用酶标二抗（针对受检抗体的抗体,如羊抗人IgG抗体）与固相免疫复合物中的抗体联合,形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物,测定加底物后的显色程度,肯定待测抗体含量.

操纵步调

⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未联合的抗原及杂质.

⑵封闭:

用高浓度无关蛋白封闭,阻拦待检血清中非特异IgG吸附固相.

⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分联合,洗涤除去未联合的非特异抗体及其他血清成分.

⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体（或酶标SPA）复合物.

⑸加底物显色.

间接法因为采取的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子（如抗人IgG）,是以该法只须要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各类与抗原响应的抗体,具有更普遍的通用性.

3.竞争法

竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定,也可反抗体进行检测.其办法和特色是：

①酶标识表记标帜抗原（抗体）与样品或尺度体中的非标识表记标帜抗原或抗体具有雷同的与固相抗体（抗原）联合的才能;

②反响体系中,固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量,且前者的联合位点少于酶标识表记标帜与非标识表记标帜抗原（抗体）的分子量和;

③免疫反响后,联合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或尺度品中非标识表记标帜抗原（抗体）的浓度成反比.

⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体.洗涤除去未联合物.

⑵参加待检标本和酶标抗原,孵育,使两者与固相抗体竞争联合.洗涤除去未联合到固相上的游离酶标抗原及其他未联合物.

⑶加底物显色.色彩深浅与待测抗原量成反比.

同理,也可用固相抗原和酶标抗体作试剂,使固相抗原和标本中的待检抗原竞争联合酶标抗体.待检抗原竞争克制酶标抗体和固相抗原联合,即待检抗原越多,显色越浅.

以抗原测定为例,先将特异性抗体衔接于固相载体,分别设置对比管和样品测定管;

对比管中仅加酶标抗原,加样后,无非标识表记标帜抗原竞争,酶标抗原即与固相抗体充分联合;

而测定管抗原与后者的联合受到克制而削减.加酶底物显色后,对比管因固相抗体上联合的酶标抗原多,显色深,测定管则依被检抗原和酶标抗原竞争联合固相抗体程度不合而显色深浅有异：

被检抗原多,酶标抗原与固相抗体联合少,底物显色反响弱,色浅;

反之呈色深.即联合于固相的酶标抗原量与样品中被检抗原浓度负相干.盘算测定管与对比管色彩深度（OD值）之差,即可肯定被检抗原量.

捕获法（亦称反向间接法）ELISA,重要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定.以今朝最经常运用的IgM测定为例,因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时消失,则后者可干扰IgM的测定.是以捕获法的工作道理设计为：

先将针对IgM的第二抗体（如羊抗人IgMμ链抗体）衔接于固相载体,用以联合（“捕获”）样品中所有IgM（特异或非特异）,洗涤出去IgG等无关物资,然后参加特异抗原与待检IgM联合;

再参加抗原特异的酶标抗体,最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物,加酶底物感化显色后,即可对样品中待检IgM是否消失及其含量进行测定.

ELSA法因为测定敏锐.特异.操纵轻便.易于主动化,且无放射性污染等诸多长处,使其不但成为今朝运用最广并且成长最快的一种免疫测定技巧.并且在办法学上的改良和衍化,使其不竭有各具特色的新测定法问世,如运用生物素-亲和素放大体系（biotin-axidinsystem,BAS）的ELISA;

运用酶催化底物发荧光的酶联免疫荧光测定（enzymelinkedimmunofluorecenceassay,ELFIA）,黑点-ELISA（dot-ELISA）和酶联免疫电转移印迹法（enzymelinkedimmunoelectrotransferblot,EITB）以及酶联免疫化学发光测定（enzymelinkedimmunochemiluminescenceassay,ELICLA）等.新办法不但进一步进步了测定敏锐.特异性,并且使ELISA技巧在进步主动化程度的同时,也便于单份样本测定和简化装备前提,尤其试用于急诊.社区诊所及家庭化验.

膜载体的酶免疫测定

固相膜免疫测定（solidphasemembrane-basedimmuoassay）与固相酶免疫测定（ELISA）相相似,其特色是以微孔膜作为固相.标识表记标帜物可用酶和各类有色微粒子,如黑色乳胶.胶体金.胶体硒等,以红色的胶体金最为经常运用.固相膜的特色在于其多孔性,像滤纸一样.固相膜可被液体穿过流出,液体也可以经由过程毛细管感化在膜上向前移行.运用这种机能树立了两种不合类型的快速检测办法.经常运用的固相膜为硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜.

㈠黑点酶免疫吸附实验

黑点-ELISA（dot-ELISA）实验道理与通例的ELISA雷同,不合之处在于黑点-ELISA所用载体为蛋白质具有极强吸附力（近100%）的硝酸纤维素（NC）膜,此外酶感化底物后形成有色的沉淀物,使NC染色实验办法为：

加少量（1~2μl）抗原于膜上,因为NC膜吸附才能强,故需在湿润落后行封闭;

然后滴加样品血清,个中的待检抗体即与NC膜上抗原联合;

洗涤后再滴加酶标二抗,最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如HRP标识表记标帜物,经常运用二氨基联苯胺）;

阳性者即可在膜上消失肉眼可见的染色黑点.黑点-ELISA的长处为：

NC膜吸附蛋白力强,微量抗原吸附完整,故检出敏锐度可较通俗ELISA高6~8倍;

试剂用量教ELISA勤俭约10倍;

操纵简略,实验及成果断定不需特别装备前提;

吸附抗原（抗体）或已有成果的NC膜可长期保管（-20℃可长达半年）,不影响其活性.

㈡免疫渗滤实验

免疫渗滤实验（IFA）的基起源基本理是：

一硝酸纤维素（NC）膜为载体,运用微孔滤膜的可滤过性,使抗原抗体反响和洗涤在一特别的渗滤装配上以液体渗滤过膜的方法敏捷完成.免疫渗滤实验最初是从黑点ELISA基本上成长树立起来的,运用的联合物是酶标识表记标帜的.20世纪90年月初成长了以胶体金为标识表记标帜物的金免疫渗滤实验（GIFA）,省却了酶对底物的反响,加倍简略.快速.渗滤装配是IFA中的重要试剂成分之一,由塑料小盒.吸水塑料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分著称.塑料小盒可所以多种外形的,盒盖的中心有一向径约为0.4~0.8cm的小圆吸孔,盒内垫放吸水塑料,NC膜片安顿在正对盒盖的圆孔下,慎密封闭盒盖,是NC膜片贴紧水塑料.如斯即制备成一渗滤装配.全部反响进程都在渗滤装配中进行,是以又常称位扁平长方形渗滤装配为反响板.

以双抗体夹心HCG为例,于小孔内滴加标本1~2滴,待完整渗入.此时标本中的HCG与NC膜上的抗βHCG相联合.再于小孔内滴加联合物试剂1~2滴,待完整渗入,金标识表记标帜的抗αHCG抗体与NC膜上的HCG形成双抗体夹心复合物.因胶体金为红色,在NC膜上消失红色黑点.在膜中心有清楚的淡红色或红色黑点显示者断定为阳性反响;

反之,则为阴性反响,黑点呈色的深浅响应地提醒阳性强度.有将包被黑点由圆点式改成短线条式的：

质控黑点横向包被成横线条,如“－”‘反响黑点纵向包被成竖线条,如“│”;

两者订交成“+”.如许,阳性反响成果在膜上显示红色的正号（+）,阴性成果则为负号（－）,目视断定直不雅.清楚明了.

㈢免疫层析实验

免疫层析实验（ICA）是继IFA之后反站起来的另一种膜固相免疫测定.与IFA运用微孔膜的过滤机能不合,ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管感化向另一端移动,如同层析一般.移动进程中被剖析物与固定于膜上某一区域的抗原或抗体联合而被固相化,无关物资则超出该区域而被分别,然后经由过程标识表记标帜物的显色来剖断实验成果.以胶体金为标识表记标帜物的实验称为金免疫层析实验（GICA）.ICA中所用的试剂全体为干试剂,它们被组合在一试剂条上.试剂条的底版为一单面胶塑料片,A.B两头粘贴有吸水材料.加样端A为样品垫,可用的材料有滤纸.多孔聚乙烯和玻璃纤维等,按剖析物和试剂的不合选择适合的材料.B端为吸水垫,材料则为吸水性强的滤纸为佳.G处为联合物垫,胶体金联合物湿润固定在玻璃纤维膜等材料上.G.B之间粘贴吸附有抗原或抗体的硝酸纤维素膜,抗原或抗体往往以直线的情势包被在膜上.一双抗体夹心法测HCG为例.试条中G处为金标识表记标帜的抗αHCG,NC膜上T处包被抗βHCG,C处包被抗小鼠IgG抗体.测试时在A端加尿液（或将A端浸入尿液中）,经由过程层析做HCG-HCG复合物;

移行至T区,形成金-抗α-HCG-HCG-抗βHCG复合物,在T区显示红色线条,为阳性反响.多余的金标识表记标帜抗αHCG移行至C区时被抗小鼠IgG抗体捕获,而显示出红色对比线条.如尿液中不含HCG,在T区不消失红色线条,仅在C区消失红色线条,实验成果为阴性.如C区无红色线条消失,暗示实验无效.

双抗体夹心法

双位点一步法

⑴将1个McAb与固相载体联络,形成固相McAb.洗涤除去未联合物.

⑵同时参加待测标本和酶标McAb,孵育,使待检抗原和固相McAb及酶标McAb反响形成双抗体夹心复合物.洗涤除去未联合物.

⑶加底物显色.

间接法

双抗原夹心法

⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未联合物.

⑵参加待检标本,孵育,使待检抗体和固相联合.洗涤除去未联合物.

⑶参加酶标抗原,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物.洗涤除去未联合物.

⑷加底物显色.

竞争法

同理,也克用固相抗原和酶标抗体作试剂,使固相抗原和标本中的待检抗原竞争联合酶标抗体.待检抗原竞争克制酶标抗体和固相抗原联合,即待检抗原越多,显色越浅.