《发酵工程实验》教案参考Word格式文档下载.docx
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液化设备有：
管式、罐式、喷射式。
加酶方法有：
一次加酶、二次加酶、三次加酶。
根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混合法。
本实验采用：
高温酶法，间歇式，罐式，二次加酶法。
间歇液化法：
配制30%的淀粉乳，PH值6.5，加入氯化钙（对固形物0.2%），加入液化酶（加酶量根据酶制剂厂商的要求），在剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15min，再加热至90℃，并维持30min，以达到所需的液化程度（DE值：
15—18%）。
碘反应呈棕红色：
最好在液化后，再升温至120℃，保持5—8min，以凝聚蛋白质，改进过滤。
4、糖化
糖化理论：
糖化的理论收率：
因为在糖化过程中，水参与反应，故糖化的理论收率为111.1%。
（C6H10O5）n+nH2O=nC6H12O6
淀粉水
16218180
糖化实际收率：
实际收率=
淀粉转化率：
指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。
淀粉转化率的计算：
转化率=
DE值：
用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。
糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质的百分比称为DE值。
DE值计算：
还原糖浓度（C2）×
100%
DE=
还原糖用裴林氏法等法测定，浓度表示：
葡萄糖g/100ml糖液；
干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：
干物质g/100ml糖液。
影响DE值的因素：
糖化时间：
最初糖化时，糖化速度快，DE值显著上升；
但24h后，当DE值达到90%以上时，糖化速度显著放慢。
液化DE值与糖化DE值的关系：
液化程度应控制适当，太低或太高均不利。
原因是液化程度低，则粘度大，难操作；
同时，由于液化程度低，底物分子少，水解机会少，影响糖化速度；
液化程度低，易发生老化；
但液化超过一定程度，则不利于糖化酶与酶与糊精生成络合结构，影响催化效率，造成糖化液的最终DE值低。
故应在碘试本色的前提下，液化DE值越低，则糖化液的最高DE值越高。
一般液化DE值应控制在12—18%。
酶制剂用量与糖液DE值的关系：
糖化时间与糖化酶用量关系表：
糖化时间（h）
6
8
10
16
24
32
48
72
糖化酶用量（u/g淀粉）
480
400
320
240
180
150
120
100
为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间。
但酶用量太高，反而使复合反应严重，最终导致葡萄糖值降低，在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖化酶用量。
糖化酶参考用量：
液化DE值17%，淀粉乳33%，60℃，pH4.5，酶制剂（NoVo-150）用量：
0.75-1ml/kg绝干淀粉，或150u/g绝干淀粉。
糖化时间36h。
糖化工艺流程：
液化结束后，迅速将料液用酸将pH调至4.2-4.5，同时迅速降温至60℃，加入糖化酶，60℃保温数小时后，当用无水酒精检验无糊精存在时，将料液pH调至4.8—5.0，同时，将料液加热至80℃，保温20min，然后将料液温度降至，开始过滤。
2.5过滤
在发酵罐内将料液冷却至60—70℃；
洗净板框过滤机，装好滤布；
接好板框滤机的管道；
泵料过滤；
热水洗涤（60—70℃）；
空气吹干；
过滤结束后，洗净过滤机及有关设备。
量取糖液体积；
取样分析还原糖浓度。
3、组织形式：
每班分为四组，每7-8个学生。
四个罐分别由四组操作，加酶量可互不相同，或分为两种，每两组选定一种酶的浓度，以便做出不同加酶量条件下还原糖动力曲线。
4、实验仪器、设备和材料
4.1设备
25升罐（可用本院25升发酵罐代替）；
装料按20升计，采用小型板框过滤机压滤，烘箱；
水桶，量筒。
4.2分析仪器
分光光度计，水浴锅，糖度计，滴定管，电炉，白瓷板，三角瓶，阿贝折光仪，比重瓶，pH计。
4.3实验主要原料：
玉米淀粉，高温液化酶和糖化酶。
5、实验分析项目和方法
分析试剂：
测定液化反应终点（碘反应）；
总糖（裴林法）；
还原糖（水杨酸比色法）的测定方法；
原料淀粉含量的测定，原料含水量的测定（烘干称重法）；
糖液透光率（分光光度计法）；
糖化终点测定（无水乙醇检验）；
糊化液和糖化液DE值；
用分光分度计对料液透光度的测定方法。
6、数据处理
在详细记录实验数据的基础上完成实验报告。
计算转化率：
各组配合实验，不同加酶量条件下还原糖浓度动力学曲线。
7、实验结果和讨论
糖化酶用量及糖化时间对糖化效果的影响；
液化和糖化温度及pH对实验效果的影响；
活性碳用量及pH对脱色效果的影响。
附录:
酸解淀粉工艺
计算配制20%（w/w）的淀粉乳所需要的淀粉和水量.称量好，盐酸用量是干淀粉的1%，先将1/3的盐酸与1/2的水混合，煮沸，剩余的水和盐酸混合，加入淀粉搅拌均匀，再与已经煮沸的盐酸水溶液混合。
在选定的温度下进行水解，（一组：
沸水浴1h左右；
二组：
先煮沸成糊状，以防淀粉沉淀，然后于121摄氏度湿热高压灭菌30min）采用无水乙醇法检测水解终点，水解完毕，搅拌冷却到60摄氏度以下，边搅拌边加入液碱，将PH调整至4.5-5.0，投入干淀粉量的0.2%-0.4%的活性炭粉，在60-70摄氏度搅拌30min,静置1-2h后，取上清夜过滤，滤液即可供发酵用。
实验二面包酵母液体深层通风发酵实验
要求学生掌握通风发酵的基本原理及过程，掌握上罐操作技术，掌握流加补料控制技术。
（1）发酵罐及管路、空气过滤器灭菌操作及发酵罐系统管路的熟悉
（2）实罐灭菌—培养基灭菌实验
（3）观察并记录酵母菌扩培过程及上罐发酵过程菌种生长变化情况
二、实验原理、
面包酵母（分子式：
C3.72H6.11O1.45N0.61+P0.035+K0.051+5.6g其它物质）培养是最典型的细胞物质生产过程。
利用葡萄糖为碳源，通风培养面包酵母的微生物反应过程可用下列化学平衡式表示：
6.67CH2O+2.10O2→C3.92H6.5O1.94+2.75CO2+3.42H2O
（碳水化合物）（酵母菌体）
20067.284.612161.6
如果在酵母菌体内再计入除碳、氢、氧以外的其它无素如氮、磷以及灰分，则每200g碳水化合物约可得到100g干酵母。
即得率约为50%。
在通风供氧充足的前提下，分批补料（流加）培养。
本实验面包酵母培养的目的是获得最大酵母浓度。
因此采用流加培养较为理想。
其原理是所谓的反巴斯德效应（CRABTREE效应）：
在酵母培养过程中，糖浓度过高时，即使溶解氧很充足，但由于糖生成乙醇，从而使菌体得率下降的现象。
（1）、分批培养：
分批培养是微生物在特定条件下只完成一个生长周期（growthcycle）的方法，即接种少量微生物在一密闭系统中生长繁殖，直到某些营养物耗尽或某些产物积聚到毒害浓度为止。
生长中微生物群体所经历的几个生长阶段分别为迟滞期（lagphase），对数生长期（exponentialphase），稳定期（stationaryphase），死亡期（deathphase）。
迟滞期
对数生长期
稳定期
死亡期
细
胞
数
对
时间（hr）
营养物质（底物）的浓度与组成影响微生物培养的生长速度，对微生物的生长起至限制作用的营养物即所谓的限制性底物。
1949年莫诺（Monod）发现微生物比生长速率与单一限制性底物存在一定联系并借助数学方法建立了著名的经验公式——莫诺方程：
s
Ks+s
μ=μm·
μ—比生长速率，单位菌体在单位时间的增殖量（h-1）
μm—最大比生长速率（h-1）
Ks—微生物对底物的半饱和常数（g/L）
S—单一限制性底物浓底（g/L）
在从对数生长期与稳定期变化的过程，可称为减速期，此时细胞比生长速率和限制性期浓度符合Monod方程。
（2）、分批补料培养（Fed-batchculture）
分批补料培养是Yoshida等（1973）创用的，是指分批培养过程中连续地补加培养基，而不从发酵器中间断地放出培养液。
这样培养液的体积随着时间延长而增加。
分批补料培养是分批培养和连续之间的一种过渡培养方式，兼有两者的优点又可克服它们的缺点，因此在发酵工业中被广泛运用。
分批补料培养中当达到最大菌体浓度时开始补加培养基，且流加培养基速率与底物被消耗速率相等，虽然菌体总数在不断增加，而细胞浓度仍为一个常数，这种状态被称为半稳态或准稳态（Quasistadystale）。
当以恒速流加培养基达到准稳态时：
稀释率D=F/（V0+Ft）.D随时间而下降。
d（xv）
dt
μXv=
生长比速率（h-1）μ===D=F/（V0+Ft）
补料液浓度（mol/L）SF=X/YX/S
补料速度（L/h）F=V0μ0
式中：
X为菌体浓度（g/L），Yx/s为基质对菌体转化率（g/mol），一般以葡萄糖为基质酵母培养时YX/S约为90g/mol。
B.上述的恒速流加在一些次级代谢产物的生产中可以用到，但在以菌体为目的的培养就不适用了。
当培养目的为获得菌体时，并要使限制性底物的浓度保持一定浓度，且菌体的比生长速率保持恒定，必须采用变速流加的方法，加料速度随时间指数增长。
理想的变速流加时体积与补料速度变化为：
醪液体积V=V0eμt
补料速度F=μV0eμt
所谓Crabtree效应即Crabtree（1929）发现，面包酵母的呼吸活力对游离的葡萄糖十分敏感，当其浓度在5μg/L时即出现阻遏作用。
为获得最大酵母得率，不能用恒速流加的方法，而保持最大生长速率的变速流加法只是理想状态。
现今酵母的分批补料发酵的生产所采有用的方法是以自动测定发酵器的排气中的微量乙醇含量来严格控制糖补入量，这样，得到的菌体量接近理论得率。
三、实验仪器、设备和材料
10升发酵罐（PH仪，培养液及酸碱液流加装置，蠕动泵），1台；
摇床，超净工作台，离心机，显微镜，分光光度计，三角瓶，面包酵母菌种，淀粉水解糖液、尿素等原料。
四、实验内容与方法：
酵母菌经扩大培养后，接入10升机械搅拌通风发酵罐培养，根据实际情况选用分批培养或分批补料培养，测定酵母浓度。
主要内容有：
试管斜面培养基的配制、面包酵母种子扩大培养基配制、流加用培养基的配制及灭菌。
总流程：
斜面培养基配制与灭菌，接种，培养
所需仪器物品：
灭菌锅、试管、棉塞、培养基原料、培养箱
300毫升种子液、500ml三角瓶三只、装液100ml、培养基、培养摇瓶、纱布。
发酵培养基制备，灭菌，接种。
离心机或板框过滤器
分批培养：
10升发酵培养基；
灭菌；
按培养条件方法接种5%培养。
面包酵母菌的培养条件及培养基组成：
酵母斜面培养基：
10º
麦芽汁固体斜面，PH5.0
酵母摇瓶培养基：
麦芽汁，PH5.0或葡萄糖10%，玉米浆1%，尿素0.2%，PH5.0
酵母分批发酵培养基：
玉米淀粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为10%、玉米浆1%，尿素0.2%，PH5.5。
发酵罐培养：
接种量2～5%，温度25℃，搅拌200r/min，通气，1VVM（根据YX/O计算最小需氧量及与菌体量的关系）
四、实验分析项目和方法
（1）酵母镜检；
（2）酵母浓度测定（比浊法：
湿重法）：
吸取10ml菌液，2500rpm离心5min，去上清液，称量菌体湿重
（3）还原糖浓度：
费林法（见工业发酵分析）
（4）发酵活力的测定（选做）：
称取0.26g鲜酵母，加5g在30℃下恒稳lh的面粉制成面。
五、实验报告内容和数据处理
实验设计原理；
发酵系统的结构与操作方法，酵母浓度随时间变化的曲线图。
附：
发酵系统介绍：
1技术指标
1.1概述
具有温度、转速、氧气流量、空气流量、pH、DO、补料、消泡显示及控制功能，并配有机械消泡浆。
1.2指标
1.2.1温度：
自动控制范围：
自来水温+5℃～50℃﹙±
0.2℃﹚显示范围：
0～150℃
1.2.2搅拌转速：
调速范围50～1000±
5rpm
1.2.3空气流量：
显示控制范围0～10L/min
1.2.4pH显示控制：
2～12pH±
0.05﹙酸碱双向﹚
1.2.5溶解氧：
0～150±
2℅
1.2.6补料、消泡蠕动泵各一台
1.2.7罐体总容积10L,设计压力2.0kg/c㎡、最高工作压力2.0kg/c㎡,设计工作温度131℃
1.2.8灭菌方法:
手动控制蒸汽消毒灭菌
1.2.9功率：
主机：
3kw,单相220v
1.2.10气源：
2～4kg/c㎡
1.2.11蒸汽：
2～4kg/c㎡
2管路说明
该流程图中空气管路阀门的标号为“AXX”,蒸汽管路阀门的标号为“SXX”，冷却水管路阀门标号为“WXX”，冷凝水管路阀门标号为“VXX”，电磁阀标号为“CXX”，物料管路阀门标号为“PXX”,冷冻水管路标号为“CWX”，其它气体管路标号为“NXX”。
2.1空气及其净化
来自空气压缩机的压缩空气经净化器（外接减压稳定器、除水、除尘、空气予过滤器）进入发酵罐空气总管，空气流量计针阀A01、阀A02、单向阀、空气过滤器，阀A03到达反应器内，尾气经阀VT1排出，本管路具有计量，净化作用。
注：
空气流量显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。
2.2蒸汽
2.2.1蒸汽进夹套
蒸汽经阀S01进入夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。
蒸汽对培养基预热。
2.2.2蒸气进反应器
蒸汽经阀S02、单向阀、空气过滤器、阀A03进入罐内，由排气口控制阀VT1排出。
蒸汽对过滤器及空气管线消毒。
2.2.3蒸汽进取样阀及放料阀
蒸汽经阀S03进入取样阀，出阀P02排出冷凝水。
2.3自来水
2.3.1自来水进夹套
当电磁阀C01打开时，自来水经自动注水阀、阀W01进入发应器夹套（下进），由夹套上口、阀W02、加热器、电磁阀C01排出；
当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电加热器、循环泵、单向阀进入夹套（下口），通过夹水套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。
特别提示：
温度自动前必须对夹套注水。
2.3.2自来水进排气冷凝器
自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基的水分蒸发
2.4冷却水（选配）（消毒后降温应优先使用自来水）
冷冻水经电磁阀C02进入加热器内盘管，对夹套循环水进行冷却。
冷冻水经切换阀T02（关T01）进入自来水管线、经切换阀T04（关T03）返回冷冻水回路。
2.5纯氧管线（选配）
纯氧管线：
纯氧进入流量计、电磁阀C03、切断阀A21进入空气过滤器。
纯氧流量调节：
开C03、A21后调节流量计的调节手柄。
2.6空气流量检测与控制：
空气热质量流量计：
与空气玻璃转子流量计并联安装且在热质量流量计前后安装切断阀。
热质量流量计内通道必须保持干燥无尘，因此只有在发酵过程中才开质量流量计的前后切断阀A11、A12，发酵结束后应及时关闭A11、A12。
（详细说明见热质量流量计的说明书）
2.7补氨水管线
氨水经电磁阀C04、切断阀A31、补料针进入发酵罐，电磁阀由控制器控制。
3实罐灭菌操作
3.1准备
3.1.1盖紧罐盖上各种罐盖，旋紧罐盖上压紧螺栓。
3.1.2标定pH、DO电极，将电极插入罐体侧面的传感器口并及时地锁紧螺母，确保安装妥当防止高压下传感器弹出伤人。
3.1.3关紧发酵罐底阀P01，倒入培养基，调整PH值，旋紧接种口
氯离子对不锈钢会带来不可逆转的破坏，因此应避免用盐酸溶液调节PH，如工艺上无法避免用盐酸，应控制盐酸浓度不大于5℅且在添加过程中不得直接接触不锈钢。
3.1.4关排气冷凝器进水W03，移去进出口的软管排尽冷凝水夹套中水
3.1.5提起过滤器使过滤器后的三通阀A03处于“S”位置。
（S—消毒，F—发酵），
3.2培养基预热
3.2.1准备工作
预热启动蒸汽发生器及空气压缩机。
将控制器中的温度控制设定为手动。
开排气阀VT1，关闭其它所有阀门。
3.2.2开排气阀VT1，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其它阀门
3.2.3启动反应器搅拌马达。
调转速200～300Rpm
3.2.4蒸汽进夹套：
缓缓开夹套蒸汽阀S01蒸汽进夹套（注意：
此时有轻微爆破声属正常，如声音过响则开阀的速度应减慢）。
待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀V01，控制蒸气排出量以有少量蒸汽排出即可。
并控制夹套内压力不超过0.2Mpa。
当培养基预热至98℃时，进入实罐灭菌操作，在培养基温度在80～90℃时可以适当的减慢升温速度，在本温度区域可以杀灭大部分的微生物。
3.2.5蒸汽进取样阀：
开出料阀P02（关紧底阀P01），开蒸汽阀S03，蒸气进入取样阀内腔，当阀P02排尽冷凝水后应调节其开度，以少量蒸汽排出即可。
3.3实罐灭菌
3.3.1过滤器消毒：
（A或B任选一种，首次消毒或每五批用“A”种消毒，其余可用“B”种消毒）
A：
外源蒸汽消过滤器：
微开过滤器上排冷凝水阀V02、V12，开过滤器前蒸汽阀S02，蒸汽经过滤器进入反应器，当冷凝水阀V02、V12出口冷凝水很少时，调节冷凝水阀以有少量蒸汽排出为宜。
当排气口有蒸汽排出或罐温达到100℃两分钟后，关闭排气阀VT1。
调节蒸汽阀S02，维持过滤器前蒸汽压为0.12～0.16Mpa。
当罐温达到100℃时，培养基中的溶氧接近零。
可以标定溶氧的零点。
B：
罐内蒸汽消过滤器：
过滤器三通阀处于“S”位置。
停搅拌，微开过滤器上排冷凝水阀V02、V12，当有罐压时，罐内蒸汽经空气管罐内三通阀进入过滤器，进V02、V12排出冷凝水。
调节冷凝水阀V02、V12以有少量蒸汽排出为宜。
当罐温达到100℃时，培养基中的溶氧接近零，可以标定溶氧为零点。
如果升温速度比较慢可以开罐底阀P01，蒸汽进入发酵罐。
3.3.2当达到预定温度或罐压，开排气阀VT1至有少量蒸汽排出，关紧或微开夹套蒸汽阀S01，微开罐底阀P01（开阀时观察视镜处培养基翻动的变化，以有少量的变化为亦），根据罐压或罐温变化的趋势，及时调整蒸汽阀S02、S03。
阀门调节宜微调应避免大幅度开关。
当反应器罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。
3.3.3保温开始后，排气阀蒸气排量不宜太小，否则可能导致液面以上的罐体部分尤其罐盖达不到消毒温度。
3.3.4保温阶段应旋松接种口盖至有少量蒸气冒出。
3.3.5移种管线消毒（适用于多级发酵）：
在保温过程中开移种管线阀P03及受种阀前排水阀V04，保温结束前关V03。
3.4灭菌完成及降温（先开后关，后开先关）
3.4.1保温结束首先旋紧接种口盖.旋紧罐底阀P01，再关紧取样器的蒸汽阀S03。
抬起过滤器使三通阀A03处于S位置，关紧蒸汽阀S02，调节过滤器冷凝水阀以有微量排气为宜。
3.4.2关夹套蒸汽阀S01、冷凝水阀V01，开夹套进水阀W01和循环管线切断阀W02.在控制器中将温度控制方式设定为“自动”并对温度进行设定，发酵罐进入自动降温。
按下搅拌开关，设定搅拌转速并“自动”控制。
3.4.3当罐压接近0.05Mpa时关阀V02，缓缓开空气管线A01、A02，空气进入发酵罐，当过滤器冷凝水阀V02排尽冷凝水后就可以关闭。
当罐压稳定后可以将三通阀A03放回“F”位置。
3.4.5在降温过程中，始终监视罐压，严禁压力掉零。
当温度达到工艺要求时，调节搅拌转速、空气流量、罐压、标定溶氧电极斜率及校正pH电极的零点。
注意：
如另配冷冻水系统消毒后降温请选择自来水降温（控制箱左侧板N2开关拨向“W”。
灭菌完毕，请勿关闭蒸气发生器，取样时需要用蒸汽
4发酵操作
4.1准备
4.1.1溶氧电极标定：
将三通阀放回“F”位置，调节空气流量、罐压、搅拌转速、罐温（为保证工艺参数的可比性，建议上面四参数维持一个固定值），标定溶氧电极斜率为100%
4.1.2pH电极零点校正：
高温消毒后pH电极的零点或多或少都会发生漂移，应预校正。
取样应用外源pH电极精确测定培养基的pH值，根据精确测定值与在线的pH值的差值在标定菜单中直接修改零点，使在线值等同于精确测定值。
4.2接种
4.2.1摇瓶倒种：
调节进气量至0.2VVM，开排气阀VT1至罐压接近零（不得大于0.02Mpa），予先旋松接种口，在接种口放好火焰圈并点燃（在火焰圈中放少量棉花可以助燃提高火焰的高度），打开接种口，倒入种子，然后旋紧接种盖，立即调高罐压。
4.2.2差压接种：
移种管线消毒：
检查受种阀P04并关紧，开冷凝水阀V04，开种子罐出料阀P02，开移种管线蒸汽阀S03，开移种管线切断阀P03，当阀P01、V04处冷凝水排尽后调节阀P02、V04以有少量水蒸气排出为宜。
消毒30分钟后，关紧阀P02、V04，关紧蒸汽阀S03并立即开受种阀P04，用发酵罐中的空气对移种管线进行保压，等移种管线冷却后就可以移种。
差压移种：
调整种子罐与发酵罐的压力，维持种子罐罐压大于发酵罐罐压约0.05Mpa，开种子罐底阀P01，种液进入发酵罐。
移种结束必须立即关紧受种阀P04，并调高发酵罐罐压。
移种管线清洗时应避免移种管线中的水压高于发酵罐罐压，以免因受种阀泄露导致发酵液被污染。
4.2.3发酵初始化：
在控制器的发酵罐状态画面输入“发酵批号”再按“就绪”或“开始”并“确认”，发酵罐数据才能自动保存。
设定发酵罐控制参数及适宜的控制模式。
4.3补料
4.3.1将经灭菌消毒的补料瓶及输液瓶放置于搁架上，用手动方式转动蠕动泵泵头，将输液管沿蠕动泵转动方向潜入蠕动泵内。
并用蠕动泵壳内的夹子夹紧软管。
4.3.2旋下补料口上闷头，用酒精棉球对补料口内橡胶
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