薄层层析的原理与操作Word格式文档下载.docx

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例如用硅胶和氧化铝作支持剂,其主要原理是吸附力与分配系数的不同,使混合物得以分离。

当溶剂沿着吸附剂移动时,带着样品中的各组分一起移动,同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。

由于各组分在溶剂中的溶解度不同,以及吸附剂对它们的吸附能力的差异,最终将混合物分离成一系列斑点。

如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开,则可以根据这些已知化合物的Rf值（后面介绍Rf值）对各斑点的组分进行鉴定,同时也可以进一步采用某些方法加以定量。

薄层层析有许多优点:

它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点,同时展开速率快,一般仅需15~20分钟;

混合物易分离,分辨力一般比以往的纸层析高10~100倍,它既适用于只有0.01μg的样品分离,又能分离大于500mg的样品作制备用,而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。

薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。

二、固定相支持剂的选择和处理

在薄层层析时,对支持剂的选择主要考虑两方面:

一是支持剂的性质与适用范围;

二是支持剂的颗粒大小。

一般来说,所选吸附剂应具有最大的比表面积和足够的吸附能力,它对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力,即有足够的分辨力;

所选吸附剂与溶剂及样品组分不会发生化学反应。

吸附力的强弱规律可概括如下:

吸附力与两相间界面张力的降低成正比,某物质溶液中被吸附的程度与其在溶剂中的溶解度成反比。

极性吸附剂易吸附极性物质,非极性吸附剂易吸附非极性物质。

同族化合物的吸附程度有一定的变化方向,例如,同系物极性递减,而被非极性表面吸附的能力将递增。

1、支持物的性质与适用范围

薄层层析的支持剂较常用的是硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚酰胺及DEAE—纤维素。

（1）硅胶

硅胶是应用最广泛的一种极性吸附剂。

它的主要优点是化学惰性,具有较大的吸附量,易制备成不同类型、孔径、表面积的多孔性硅胶,一般以SiO2?

xH2O通式表示。

硅胶的吸附活性取决于含水量,吸附层析一般采用含水量为10%~12%的硅胶,含水量小于1%的活性最高,而大于20%时,吸附活性最低。

用加热脱水法可使硅胶活化,降低吸附活性的硅胶能显著改善分离性能,增加样品的负载量。

硅胶适用于分离酸性和中性物质,碱性物质能与硅胶作用,因此如用中性溶剂展开,碱性物质有时留在原点不动,或者斑点拖尾,而不能很好地分离。

为了使某一类化合物得到满意的分离,可改变硅胶酸碱性。

例如,可用稀酸或稀碱液（0.1~0.5mol/L）或一定pH值的缓冲溶液代替水制备酸性、碱性或某一pH值的薄层;

也可在硅胶中加入氧化铝（碱性）制成薄层;

或在展开剂中加入少量的酸或碱进行展层。

使用硅胶和硅藻土时,通常要先加入粘合剂再在支持板上涂布。

常用的粘合剂为煅石膏和淀粉,在硅胶、氧化铝和硅藻土中分别加入5%~20%石膏后,称为硅胶G、氧化铝G和硅藻土G。

用煅石膏为粘合剂的薄层易从玻璃板上脱落,但具有耐腐蚀性试剂的优点。

加淀粉制成的薄层,机械性能较好,但不宜用腐蚀性强的试剂。

（2）氧化铝

氧化铝为微碱性吸附剂,适用于亲脂性物质的分离制备,氧化铝具有较高的吸附容量,价格低廉,分离效果好,因此应用也较广泛。

在使用氧化铝作吸附层析时,要注意选择适当活性及适当酸碱度的产品。

氧化铝通常可按制备方法不同而分为碱性、中性和酸性三种。

碱性氧化铝可应用于碳氢化合物的分离;

中性氧化铝适用于醛、酮、醌、某些苷类及酸碱溶液中不稳定的酯、内酯等化合物的分离;

酸性氧化铝适用于天然及合成的酸性色素以及醛、酸的分离。

（3）聚酰胺

聚酰胺由己二酸与己二胺聚合而成,也可用己内酰胺聚合而成,因它们都含有大量酰胺基团,故统称聚酰胺。

聚酰胺薄膜层析是1966年后发展起来的一种薄层层析方法,用此方法分析氨基酸衍生物DNP-氨基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸及DABTH-氨基酸时,具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优点。

目前由国产原料制成的聚酰胺薄膜性能良好、效果满意,已用于酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸碱基、核苷、核苷酸、杂环化合物、合成染料;

磺胺、抗菌素、环酮、杀虫剂及维生素B等16类化合物的分析。

（4）硅藻土和纤维素

它们是中性支持剂,需在吸附水、缓冲溶液或甲酰胺等之后,才能用于薄层层析。

2、支持剂的颗粒大小

用作薄层层析固定相的支持剂颗粒,要求大小适当、均匀。

颗粒过大,展开时溶剂推进速率太快,分离效果不好;

颗粒太小,展开太慢,斑点拖尾不集中,分离效果也差。

颗粒大小固定在一定范围内并且薄层厚度均匀一致时,每次得出的Rf值即可保持恒定。

无机类支持剂的颗粒以150~200目（直径为0.07~0.1mm）、薄层厚度为0.25~1mm较合适。

有机吸附剂如纤维素等的颗粒为70~140目（直径0.1~0.2mm）、薄层厚度为1~2mm最恰当。

三、薄层板制作

薄层板制作简称制板,是指作为固定相的支持剂被均匀地涂布在玻板上,形成一薄层。

所用的玻板要

求表面平滑、清洁。

玻板的大小按需要选定,常用的规格为6cm×

20cm、20cm×

20cm及2.5cm×

7.5cm。

1、软板制作

软板也称干板,是不加粘合剂,将支持剂干粉直接均匀地铺在玻板上制成的。

这种薄层板制作简单,展开快,但极易吹散。

其具体制作方法如下:

（1）选用直径约为0.5cm的玻璃管一根,根据薄层的厚度（一般为0.4~1mm）在其两端绕胶布数圈。

（2）将支持物干粉倒在玻板上,固定玻板一端以防玻璃推进时移动。

（3）将玻璃管压在玻板上,将支持剂干粉由一端推向另一端即成薄层。

2、硬板制作

硬板或称湿板,是将支持剂加粘合剂和水或其他液体后,均匀地铺在玻璃板上,再经烘干而成的薄层板。

制作方法可用专门的薄层制板器,也可用手工,均能得到满意的效果。

下面介绍三种手工涂布制板的方法:

（1）玻棒涂布

将支持剂用水或适当溶剂调成胶浆,倒在玻板上,然后依软板制作相同方法,用玻棒在玻板上将支持剂由一端向另一端推动,即成薄层。

（2）玻片涂布

在玻板两旁放置两块稍厚的玻板,把支持剂胶浆倒在中间的玻板上,然后用另一块玻片的边缘将胶浆刮向另一端,即成一定厚度的薄层。

干燥后用刀刮去薄板两侧的支持剂。

更换玻板两旁不同厚度的玻片,即可调节薄层的厚度。

（3）倾斜涂布

将支持剂胶浆倒在玻片上,然后将玻板倾斜,使胶浆均匀涂布于玻板上。

上述任何一种方法将支持剂均匀涂布于玻板上后,静置片刻,待薄层表面无水渍后,置烘箱中,让温度升到100℃,持续1小时。

关闭电源,待温度降至接近室温时,取出薄层板,放入干燥器备用。

此一步骤称为活化。

四、点样

点样是将经处理后的样品点加在薄层的特定部位,这是一项需要十分仔细的操作步骤,点样的好坏会直接影响分离效果。

点样可用玻璃毛细管,如作定量测定,应使用微量移液管或微量注射器,市售血球计数管经加工磨尖头部并标定体积后使用也甚理想。

点样的位置,上行展开法一般点样在离薄层下端4~5cm处,下行展开法在离上端6~8cm处。

如作双相纸层析分离,点样处应位于距薄层右侧边5cm与距底边5cm直线的交点。

薄层层析点样方法应注意以下几点:

（1）样品最好用具挥发性的有机溶剂（如乙醇、氯仿等）溶解,不应用水溶液,因水分子与吸附剂的相互作用力较弱,当它占据了吸附剂表面上的活性位置时,就使吸附剂的活性降低,而使斑点扩散。

（2）点样量不宜太多,否则会降低Rf值,一般为几到几十μg,体积为1~20μg。

（3）原点直径要控制在2mm以内。

欲达此目的,就须分次点样,边点样,边用冷、热风交替吹干。

（4）薄层板在空气中不能放置太久,否则会因吸潮降低活性。

五、展层

1、展开剂的选择

选择展开剂须视被分离物的极性及支持剂的性质而定。

对初选展开剂合适与否的评价,要根据其分离有效成分的效果来确定。

如果不合适,还需进行极性调整,直到达到对有效成分的完全分离为止。

如果薄层层析所用的支持剂是吸附剂,在同一吸附剂上,不同化合物的吸附性质有如下规律:

①饱和碳氢化合物不易被吸附;

②不饱和碳氢化合物易被吸附,分子中双键愈多,则吸附得愈紧密;

③当碳氢化合物被一个功能基取代后,吸附性增大。

吸附性较大的化合物,一般需用极性较大的溶剂才能推动它。

选择展开剂的另一个依据是溶剂的极性大小。

一般而论,在同一种支持剂上,凡溶剂的极性愈大,则对同一性质的化合物的洗脱能力也愈大,即在薄层上能把此化合物推进得愈远,Rf值也愈大。

如果用一种溶剂去展开某一成分,当发现它的Rf值太小时,可考虑换用一种极性较大的溶剂,或在原来的溶剂中加入一定量极性较大的溶剂进行层析。

溶剂极性大小的次序是:

石油醚<

二硫化碳<

四氯化碳<

三氯乙烯<

苯<

二氯甲烷<

氯仿<

乙醚<

乙酸乙酯<

乙酸甲酯<

丙酮<

正丙醇<

甲醇<

水。

2、展层

展层装置种类较多,根据展层方式基本上可分上行、下行、连续及水平式四种。

不加粘合剂的薄层只能作近水平式（板与水平成10度~20度角）的上行或下行展开。

不论何种展层方式,展层容器必须关闭,并事先要使展开剂蒸气达到饱和。

容器的体积大小要视薄层板的面积而定,因为大容器要达到溶剂蒸气饱和所需的时间比小的长。

根据实验证明,在不饱和的展层装置中,由于混合展开剂内含有几种挥发性试剂,致使薄层板边缘与中间的试剂比例不同,因此样品在边缘和中间展层的距离也不同,这种现象称为边缘效应,严重时会影响分离效果。

薄层层析时为了获得更好的分离效果,可采用双向展层和分次展层。

分次展层是先用一种溶剂展开至一定距离后,将薄层板取出,待溶剂挥发后再按同一方向用第二种溶剂展开。

六、显色和定量

薄层板展开完成后,从展开装置中取出,于室温或烘箱中干燥,然后根据被分离物质的种类和性质,选用相应的显色剂喷雾显色,或用紫外灯检测被分离的物质斑点,测量和计算各斑点的Rf值。

通过薄层层析被分离的各种溶质组分在滤纸上移动的速率通常用Rf表示:

Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离=原点至组分斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离。

在薄层、溶剂、温度等各项实验条件恒定的情况下,各物质的Rf值是不变的,它不随溶剂移动距离的改变而变化。

Rf与分配系数K的关系:

Rf=1/（1+αK）

α是由薄层性质决定的一个常数。

由此可见,K值愈大,溶质分配于固定相的趋势愈大,而Rf值愈小;

反之,K值愈小,则分配于流动相的趋势愈大,Rf值是定性分析的重要指标。

在样品所含溶质较多或某些组分在单相薄层层析中的Rf比较接近,不易明显分离时,可采用双相薄层层析法。

该法是将滤纸在某一特殊的溶剂系统中按一个方向展层以后,即予以干燥,再转向90度,在另一溶剂系统中进行展层,待溶剂到达所要求的距离后,取出薄层,干燥显色,从而获得双相层析谱。

应用这种方法,如果溶质在第一种溶剂中不能完全分开,而经过第二种溶剂的层析能得以完全分开,大大地提高了分离效果。

由于薄层层析在分析定量时需注意以下几点:

（1）在喷雾显色时,不加粘合剂的薄层要小心操作,以免吹散吸附剂。

（2）薄层层析还可以用强腐蚀性显色剂,如硫酸、硝酸、铬酸或其他混合溶液。

这些显色剂几乎可以使所有的有机化合物转变为碳,如果支持剂是无机吸附剂,薄层板经此类显色剂喷雾后,被分离的有机物斑点即显示黑色。

此类显色剂不适用于定量测定或制备用的薄层上。

（3）如果样品斑点本身在紫外光下不显荧光,可采用荧光薄层检测法,即在吸附剂中加入荧光物质,或在制备好的薄层上喷雾荧光物质,制成荧光薄层。

这样在紫外光下薄层本身显示荧光,而样品斑点不显荧光。

吸附剂中加入的荧光物质常用的有1.5%硅酸锌镉粉,或在薄层上喷雾0.04%荧光素钠、0.5%硫酸奎宁醇溶液或1%磺基水杨酸的丙酮溶液。

（4）由于薄层边缘含水量不一致,薄层的厚度、溶剂展开距离的增大,均会影响Rf值,因此在鉴定样品的某一成分时,应用已知标准样作对照。

（5）定量时,可对斑点作光密度测定,也可将一个斑点显色,而将与其相同Rf值的另一未显色斑点从薄层板上连同吸附剂一起刮下,然后用适当的溶剂将被分离的物质从吸附剂上洗脱下来,进行定量测定。

七、薄层层析法的近代发展

薄层层析法由于其本身所具有的许多优点,几十年来,在混合物的分离、定性及定量分析中的应用相当普遍,并逐渐取代了纸层析分离技术。

为了克服薄层层析法存在的某些不足,获得更有效的分离效果,在薄层制备、展开方式、分析鉴定手段以及相配套的仪器设备等方面近年来进行了许多革新,其中最根本的是支持剂的改进。

以一种直径更小的支持剂颗粒替代常规的支持剂剂型所制备的薄层,比常规的薄层具有所需样品少、展开速率快、距离短、分辨力高等优点;

而且此种新型的薄层具有较好的光学特性,更有利于对分离斑点进行光密度扫描。

为了区别于常规的薄层层析分析法,通常将此种新方法称为高效薄层层析法（highperformancethin-layerchromatography,HPTLC）,也称现代薄层层析法（modernTLC）。

在进行HPTLC时,为了保证恒定的吸附剂活性和薄层板的相对湿度,预制板可用固定相浸渍剂加以处理。

经处理后的薄层板一般不再受外界湿度的影响。

固定相浸渍剂分两类:

①亲水性固定相,多数用甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇和不同相对分子质量的聚乙二醇或不同种类的盐溶液浸渍;

②亲脂性固定相,一般作反向层析用,多数用液体石蜡、十一烷、十四烷、矿物油、硅酮油或乙基油酸盐等浸渍。

也有利用与浸渍剂形成络合物或加成物得以分离的,如经三硝基苯或苦味酸浸渍的,可利用络合反应分离多环化合物。

用NaHSO2浸渍,可与含有羰基化合物生成加成物而得以分离。