DNA的复制机制Word格式.docx
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一模板链配对）的
3‘-OH
端的逐步添加。
新合成的
链因此是以
5‘-3’的方向聚合的，
正如前一幅图所示。
因为每个新来的三磷酸脱氧核糖核苷必须和模板链配对以被
聚合酶识
别，模板链决定了哪种脱氧核糖核苷酸（A,T,C,或者
G）将被添加。
焦磷酸盐的释放及其后续水
解为两个无机磷酸盐分子导致巨大的有利的自由能改变，驱动了脱氧核苷酸的添加反应。
（
B）
一个由
X-线晶体学确定的大肠杆菌
聚合酶分子结构。
通俗的讲，它就像一只右手，手掌
手指和大拇指握住
该图示例的是一个在
修复时起作用的
聚合酶，但是复制
的酶有相似的特征。
复制叉非对称
在细胞内
复制期间，每条旧
链都作为形成一条完整新链的模板。
因为一个分裂细胞
的两个子细胞都遗传了包含旧链和新链的新
双螺旋（Figure
5-5
），该
双螺旋据说
是被
聚合酶半保留复制。
这一任务是如何完成的呢？
复制的半保留性质
在一轮复制中，DNA
的每条链都用左形成互补链的模板。
原始
链因此经历很多代而完好无损。
1960
年代早期对完全复制的染色体进行的分析发现，一个局部的复制区域沿母
双螺旋向
前移动。
因其
Y
形结构该活跃区域被称为复制叉（Figure5-6）在复制叉处，两条新的子链被一
个包含
聚合酶在内的多酶复合物合成。
5-6
在一个环形染色体上两个复制叉朝
相反方向移动。
一个活跃的
复制区域沿正在复制的
分
子向前移动，形成一个
形
结构即复制叉：
的两条臂是两个子
分子，Y
的茎是母
DNA
螺旋。
图中，母链为橙色；
新合成的链为红色。
合成中不存在
3‘-5’的
聚合，只有
5‘-3’。
Figure5-7
一种不正确的
复制模
型。
虽然看起来像是最简单的
复制
模型，这里所示例的机制并非细胞使用
的。
在这个方案中，两条子
链都连
续增长，利用两个末端磷酸（图中发红光
黄圈所示）水解的能量在每条链上添加下
一个核苷酸。
这就要求链既以
5‘-3’方向增长也以
3‘-5’方向增长。
催化
3‘-5’方向的核
苷酸聚合的酶尚未发现。
那么，3‘-5’方向的总体链增长是如何实现的呢？
答案是冈崎片段——复制叉处短暂存在的
1000-2000
个核苷酸长度的
碎片（真核生物中也有相似的复制中介，长度只有
100-200
个核苷酸）。
冈崎片段只以
5‘-3’链方向被聚合而成，合成以后被连接在一起形成连续的长
链。
复制叉因此具有一个不对成的结构（Figure
5-8）.
被连续合成的子链叫前导链，其合成稍微领
先于另一条非连续的合成子链，即后随链。
后随链的核苷酸聚合方向和
链的总体增长方向
相反。
后随链合成之所以要延迟，是因为必须等待前导链将合成冈崎片段的模板链暴露出来。
后
随链通过一种不连续的“后缝”机制合成意味着
复制只需要
5‘-3’类型的
聚合酶。
5-8
复制叉结构。
因为两条
子链都以
5‘-3’方向聚合，后随链上的
合成开始时必须被做成一系列短的
分子，称为冈崎片段。
复制的高保真要求几种校对机制
正如本章开始所述，复制期间拷贝
的保真度为每
109
个拷贝的核苷酸中大约有
1
个错误。
基于碱基互补配对的准确度，这一保真度比预期要高得多。
标准的互补碱基配对对并非唯一的互
补配对形式，比如，在螺旋几何中一些小的变化，DNA
中
G
之间即可形成两个氢键。
另外，
四种
碱基会短暂出现稀少的互变异构体形式，比例为
比
104
或
105.这些互变异构形式不
改变螺旋几何即可发生错配：
例如，C
稀少的互变异构形式与
相配，而不是和
G。
当新来的三磷酸脱氧核糖核苷和
模板发生错配时，如果
聚合酶不做什么特殊的事，
这个错误的核苷酸就会被包含在新
链中，产生频繁的变异。
复制的高保真度不仅依
靠互补配对，还依靠几种校对机制顺序执行以修正任何可能已经出现的初始错配。
第一个校对步骤，由
聚合酶在新核苷酸被加在增长链上之前执行。
首先正确的核苷酸比不
正确的核苷酸对移动的聚合酶有更高的亲和力，因为只有正确的核苷酸睬可和模板正确配对。
此
外，核苷酸键联之后，共价地添加到增长链上之前，DNA
聚合酶必须进行一次构象改变。
一个
不正确的核苷酸比正确的核苷酸更有可能在这一步脱离。
这一步因此让聚合酶在催化添加核苷酸
之前两次检查准确的碱基配对几何。
下一步错误修正反应，核酸外切校对.
聚合酶不能通过连接两个三磷酸脱氧核糖核苷来开
始一条新多聚核苷酸链，而是绝对要求一条引物链已碱基配对的
端来进一步添加核苷
酸（见
5-4）。
所以如果引物链
3’-OH
端的核苷酸错配了，DNA
聚合酶就不能延伸这
样一条链。
聚合酶分子在一个分开的催化位点（根据具体的聚合酶，在该聚合酶分子的一
个分开的子单元或者分开的域里面）处理错配的引物链。
进行校对的核酸外切酶沿
3‘-5‘方向
切除掉引物链
3’端任何未配对残基，直到足够的核苷酸被移除，重新生成了一个碱基配对的
3
‘-OH
端，可引导
合成。
这样，DNA
聚合酶又作为一个“自我修正”酶，沿
移动
时移除掉自己的聚合错误（Figures
5-9
5-10）
聚合酶在
复制期间的核酸外切校对。
在本例中，错配是因为包含了一个稀有的短暂的
C
碱基互变异
构体形式（星号所示）。
同样的校对机制适用于在
端
的任何其他错误包含的核苷酸。
5-10
聚合酶和
模板络合物在聚合模式（A
左和编辑模式（右）下的结构略图。
E
为核酸外切反应的催化
位点，P
为聚合反应的催化位点。
对完美配对的引物终端的要求对于
的自我修正性质是很
重要的。
聚合酶在没有引物的情况下开始合成，要完全正确区分配对的和未配对的
3‘-OH
端，很明显不可能.相反，基因转录中的
RNA
聚合酶不需要有效的核酸外切校对：
中的错
误把不会传给下一代，偶尔的缺陷
分子无长期影响。
因此
聚合酶可以无需引物即开
始合成.
在
合成以及单独的
mRNA
翻译过程中，都发现了大约
1/104的错误频率。
这一水平比
复制的错误率高
100，000
倍。
是一系列校对过程使得
复制过程相当的准确（table
5-1）。
table
5-1
促进
高保真合成的三部曲。
第三部，链指导错配修复，本章后续将介绍。
链指导错配修复系统移除复制错误移除从复制机器逃脱的
错误
正如前面所述，细菌如大肠杆菌能够每
30
分钟分裂一次，使得从大量菌株中筛选找出一个稀有
的在某一特定过程中发生改变的变种细胞相对容易。
一个有趣的变种类型，包含了所谓增变基因
中的改变，增变基因大大增大了自发突变率，即使在它们未激活时。
并不奇怪的是，一个这样的
变种所产生的的
3‘-5’校对核酸外切酶（DNA
聚合酶的一部分，见
Figures
5-10）是
有缺陷的形式。
当
3‘-‘5’的核酸外切酶校对有缺陷时，DNA
聚合酶不再有效率地校对，许
多本来可以被移除的错误在
中累积起来。
对其他非正常高变异率的大肠杆菌变种的研究发现了另一种校对系统，该校对系统移除由
聚合酶产生而被校对核酸外切酶错过的错误。
链指导错配修复系统，检测
螺旋中由于非互
补碱基对不匹配而造成的潜在的扭曲。
但是如果该校对系统仅仅识别新复制的
中的错配，
随机修正两个错配核苷酸中的一个，就可能错误地修正原始模板链来匹配错误，因而不能降低总
体错误率。
为了有效，这样一个校对系统必须能够区分和移除新合成链上的错配核苷酸，新合成
的链才是错误发生的地方。
大肠杆菌中的错配校对系统所使用的链区分机制是依靠
GATC
序列中
残基的甲基化。
唯一未被甲基化的
序列位于紧随复制叉后面的新链中。
新链和旧链的识别就是通过未被
甲基化的
的识别来实现的。
链指导错配修复的三步过程包括：
错配的识别，从新链中切
除包含错误的
片段，以旧链为模板重新合成被切除的片段——从而移除了错配。
链指导错
配修复系统减少了
复制期间的错误数量，见
5-1.
真核生物中，在错配位点区分新链和模板母链的机制不是依靠
甲基化。
事实上，有些真核
生物——包括酵母和果蝇——不会甲基化其任何
新合成的链具有刻痕，生化专家揭示了
这些刻痕（也被称作单链裂口）在真核生物中为链指导错配修复系统提供了信号，指导其去修复
合适的链（新链）。
5-23
真核生物中的链指导错配修复模型
（A）The
two
proteins
shown
are
present
in
both
bacteria
and
eucaryotic
cells:
MutS
binds
specifically
to
a
mismatched
base
pair
while
MutL
scans
the
nearby
for
nick.
Once
a
nick
is
found,
triggers
degradation
of
nicked
strand
all
way
back
through
the
mismatch.
Because
nicks
largely
confined
newly
replicated
strands
eucaryotes,
replication
errors
selectively
removed.
In
bacteria,
mechanism
same,
except
that
an
additional
protein
complex
（MutH）
unmethylated
（and
therefore
newly
replicated）
sequences,
thereby
beginning
process
illustrated
here.
（B）
The
structure
bound
This
dimer,
which
grips
double
helix
as
shown,
kinking
at
pair.
It
seems
that
MutS
mismatches
by
testing
sites
can
be
readily
kinked,
are
those
without
normal
complementary
（B,
from
G.
Obmolova
et
al.,
Nature
407:
703–710,
2000.
©
Macmillan
Magazines
Ltd.）
只有
5‘-3’方向的
复制允许有效的错误修正
5-11An
explanation
5′-to-3′
direction
of
chain
growth
Growth
5′-to-3′
direction,
on
right,
allows
to
continue
be
elongated
when
mistake
in
polymerization
has
been
removed
by
exonucleolytic
proofreading
（see
5-9）.
contrast,
hypothetical
3′-to-5′
scheme,
left,
would
block
further
chain
elongation.
For
convenience,
only
primer
shown.
一种特殊的聚合核苷酸的酶在后随链上合成短
引物分
子
对于前导链，仅在复制开始时需要一个特殊的引物：
一旦复制叉建立起了，
聚合酶就将持
续地面对一个配好对的链端以添加新核苷酸。
然而，在复制叉的后随链上，
聚合酶每次完
成一条新的冈崎片段（几秒钟），必须在模板链更前方
的位点开始合成一个全新的片段（见
Figure5-8）。
一
个专门的机制产生
聚合酶所需的碱基配对的引物
该机制包括一种叫
引物酶的酶，用三磷酸核糖
核苷酸在后随链上合成短的
引物（Figure
5-12
）.
在真核生物中，这些引物大约为
10
个核苷酸长度，在后
随链上间隔
100-200
个核苷酸。
引物合成
schematic
view
reaction
catalyzed
primase,
enzyme
synthesizes
short
primers
made
lagging
using
template.
Unlike
polymerase,
this
start
new
polynucleotide
joining
nucleoside
triphosphates
together.
primase
5′
-to-3′
direction
then
stops,
making
3′
end
vailable
polymerase.
因为
引物包含合适的碱基配对的具有
端的核苷酸，所以可被
聚合酶在该端
延长，以开始冈崎片段。
当在
聚合酶遇到上一个冈崎片段的
引物时，冈崎片段的合
成即终止。
为了将这些
片段生成连续的
链，一个专门的
修复系统迅速行动，
擦除旧的
引物，以
代替之。
最后，一种叫
连接酶的酶，将新
片段的
3’
端和上一个片段的
5‘端连接起来（Figures
5-13
5-14）。
5-13The
synthesis
one
many
fragments
strand
eucaryotes,
intervals
spaced
about
200
nucleotides
lagging
strand,
each
approximately
10
long.
erased
special
repair
（an
RNAse
H）
recognizes
an
RNA/DNA
it;
leaves
gaps
filled
polymerase
ligase.
5-14The
ligase
seals
broken
phosphodiester
bond.
As
ligase
uses
molecule
ATP
activate
（step
1）
before
forming
bond
2）.
way,
energetically
unfavorable
nick-sealing
driven
being
coupled
favorable
hydrolysis.
专门的蛋白质在复制叉前面打开
双螺旋
为了
合成的推进，DNA
双螺旋必须在复制叉前面被打开，这样新来的核苷酸才能和模板
链形成碱基对。
双螺旋在正常条件下非常稳定，试管中必须要接近沸水的温度才能将两条
链分开。
只有当模板链已经从其互补链分离开来而暴露出来时，
引物酶才
能拷贝
两种蛋白质——DNA
解旋酶和单链
结合蛋白，帮助打开双螺旋从而为
聚合酶提供合适的单链
模板来进行拷贝。
解旋酶首先和
单链结合，通过水解
周期性地改变其自身形状，从而进行机械运
动，即推动自己沿
单链快速前移，当碰到双螺旋区时，继续前进，以
个核苷酸对每
秒的速度将双螺旋撬开（Figures
5-15
5-16）。
An
assay
used
test
helicase
enzymes
fragment
annealed
long
single
form
region
helix.
double
melted
runs
along
single
releasing
requires
presence
helicase
ATP.
rapid
step-wise
movement
powered
its
hydrolysis
5-16The
structure
（A）
diagram
hexameric
ring.
Schematic
showing
replication
fork
scale.
（C）
Detailed
bacteriophage
T7
replicative
helicase,
determined
x-ray
diffraction.
Six
identical
subunits
bind
and
hydrolyze
ordered
fashion
propel
this
passes
central
hole.
Red
indicates
bound
molecules
structure.
单链
结合（SSB）蛋白，非常合作地紧紧结合在暴露出来的
单链上，而不覆盖其要做模板的碱
基。
这些
SSB
蛋白不能直接打开一个长
螺旋，但是它们通过稳定
升级会员 