得到发光大肠杆菌的实验设计Word文件下载.docx

得到发光大肠杆菌的实验设计Word文件下载.docx

《得到发光大肠杆菌的实验设计Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《得到发光大肠杆菌的实验设计Word文件下载.docx（9页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

Buffer、MgCl2、4×

dNTP、引物、Taq酶、质粒DNA模板、琼脂糖、Goldview。

3.设备：

移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统。

注：

绿色荧光蛋白引物：

p1Ndel/p2Xhol

正向引物-p1：

5'

-gggcatatggtgagcaagggcgaggag-3'

反向引物-p2：

-gggctcgagttacttgtacagctcgtccatg-3'

PCR实验步骤：

1.在0.2mLEP管内配制50μLPCR反应体系1个：

ddH2O34μL、10×

Buffer5μL、MgCl23μL、4×

dNTP2μL、正向引物1μL、反向引物1μL、Taq酶1μL、质粒DNA模板3μL。

2.混合后瞬时离心。

3.放入PCR仪中，设置反应程序：

①94℃预变性5min；

②94℃变形30s；

③55℃退火30s；

④72℃延伸60s；

⑤重复步骤②~④30次；

⑥72℃延伸10min。

4.取5μL反应液加1μL10×

loadingBuffer做电泳检测，分析所得目的片段的大小。

DNA连接实验用品：

酶切后的EGFP、pET-28a，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套。

T4DNA连接酶，ddH2O，T4DNA连接酶buffer。

移液器，台式高速离心机，PCR仪。

DNA连接实验步骤：

1.在0.2mlEP管中配置下列体系：

10×

buffer2.5μL、酶切后的pET-28a7.5μL、酶切后的EGFP（绿色荧光基因片段）13μL、T4DNA连接酶（考虑连接效率）2μL、X:

Y=1:

10~30，总体积25μL。

2.EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22℃反应20min，-20℃下保存用于转化实验。

重组质粒转入DH5a扩增，菌落PCR鉴定阳性克隆：

（二）、质粒的提取和凝胶电泳的检测

电泳：

带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。

DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。

DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。

因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。

在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：

线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。

当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：

闭环超螺旋〉线状〉开环。

但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。

试剂:

1、质粒快速提取试剂盒

溶液1（SET缓冲液）、溶液2（LysisBuffer）、溶液3（3MNaAc,Ph4.8）、结合缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液、吸附柱、废液收集管

2、电泳检测

TAE缓冲液、琼脂糖、Loadingbuffer、EB

仪器、耗材：

台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、移液器、1.5mlEppendorf管

操作步骤：

（1）培养细菌:

大肠杆菌接种到LB培养基2ml-5ml中,37度振荡培养8-16小时.

（2）收集菌体：

取培养液1.5ml于Eppendorf管中,12000rpm离心3分钟,去掉上清液.

（3）裂解：

加入100ul溶液1（用完后4度保存）,充分吹打混匀后,加入150ul溶液2（用完立即拧紧瓶盖）,温和颠倒5-10次,零下20度放置3分钟.加入150ul溶液3,温和颠倒5-10次,放置5分钟.12000rpm离心5分钟

（4）收集质粒：

取吸附柱，加入420ul结合缓冲液，取离心后的上清液到吸附柱中（不要吸到蛋白沉淀），混匀.12000rpm离心30秒,弃去废液.吸附柱装回收集管。

（5）向吸附柱加入700ul漂洗液，12000rpm离心30秒。

倒掉废液，装回吸附柱。

（6）重复（5），再次12000rpm离心2分钟以完全去除漂洗液。

（7）回收质粒：

将吸附柱移到一个新的1.5mleppendorf管中，向吸附膜中央加入50ul洗脱缓冲液（水浴预热至70度），溶解提取物,室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟.

（8）琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.

重组质粒的构建

（三）、目的基因片段的酶切

原理：

DNA限制性内切酶是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。

由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。

BamHⅠ切割识别序列后产生的粘性末端：

5'

⋯G↓GATCC⋯3'

→5'

⋯GGATCC⋯3'

3'

⋯CCTAG↑G⋯5'

→3'

⋯CCTAGG⋯5'

NotI切割识别序列后产生的粘性末端：

⋯GC↓GGCCGC⋯3'

→5'

⋯GCGGCCGC⋯3'

⋯CGCCGG↑CG⋯5'

→3'

⋯CGCCGGCG⋯5'

实验用品

1材料：

提取的质粒pEGFP-N3和pET-28a，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套

2试剂：

NotI,BamHI,ddH2O（双蒸水保证杂质基本去除，防止DNA降解），10×

buffer（目的是给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件），琼脂糖，Goldview（可代替溴化乙锭的新型核酸染料，GoldView™与核酸结合后能产生很强的荧光信号，在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光）

3设备：

移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱

实验步骤

1、分别取两支0.2mlEP管做上记号：

如①②

2、两个EP管中分别配置下列的30μL体系：

①EP管②EP管

BSA3μLBSA3μL

buffer3μL10×

buffer3μL

NotⅠ2μLNotⅠ2μL

BamHⅠ2μLBamHⅠ2μL

pET-28a20μLpEGFP-N320μL

3、将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱370C酶切3h。

4、取5μL①②EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果。

5、按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段

（四）目的基因片段和载体的扩增

（1）PCR-聚合酶链式反应：

1、将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分

PCR反应体系各成分的量

•template0.1ul

•P1（20mM）0.2ul

•P2（20mM）0.2ul

•dNTPs（10mM）0.4ul

•Taqs（5U/l）0.2ul

•10×

PCRbuffer2ul

•ddH2O16.9ul

•Total20ul

2、将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。

预变性95℃3min，变性95℃30s，退火60-55℃30s，延伸72℃1min10个循环，每个循环降0.5℃。

变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min20个循环，72℃延伸2min。

3、PCR扩增完毕后，取出PCR管放在冰盒上。

4、取8ul扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。

（2）琼脂糖凝胶电泳检测

1、称取0.8g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100mL1×

TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60℃左右。

2、轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。

3、将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。

4、取5μL①②EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照分别加入样孔中。

5、接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100V,I=30mA。

6、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

7、在凝胶成像分析系统中观察结果。

8、按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段

（五）、DNA的连接重组

（1）实验原理：

•连接的DNA分子具备的条件：

具有相同粘性末端（同种酶切的片段）的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构。

•连接反应温度：

理论上讲，连接反应的最佳温度是370C，此时连接酶的活性最高。

但370C粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一个最适温度，即12~160C，连接过夜。

但现在公司提供的连接酶只需要220C连接20分钟即可。

（2）实验用品

酶切后的质粒pET-28a，酶切后的目的基因片段，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套

T4DNA连接酶,ddH2O，T4DNA连接酶buffer

移液器，台式高速离心机，PCR仪

（3）实验步骤

1、在0.2mlEP管中配置下列的体系：

0.2mlEP管

buffer2μL

T4DNA连接酶0.5μL

酶切后的GFP片段9.5μL

酶切后的pET-28a质粒8μL

2、液体混匀后置于1.5ml离心管中瞬时离心，放入培养箱220C温育20min后，-200C下保存用于转化。

（六）、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

重组质粒转入DH5a扩增实验步骤：

1.取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，5μLpET-28a-EGFP质粒加入200μL解冻的感受态细胞中，轻弹混匀后冰浴30min。

2.42℃热冲击90秒，立即置于冰浴5min。

3.在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB液体培养基，于37℃摇床中培养1h。

4.1h后，6000r/min离心5min，去掉部分上清（约留200μL的培养液），移液器吹打混匀菌液，再加入200μL的24mg/mlIPTG混匀。

5.移液器吸取混匀溶液于含Kana的LB固体培养基上，用玻璃涂布器将其均匀涂布，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜。

6.下次实验室观察结果。

（七）、扩大培养

培养导入重组质粒的大肠杆菌

（八）、GFP蛋白的诱导表达

1．目的蛋白的表达

（1）含外源基因的表达菌株在LB培养基（含50μg/mlKana）中预培养过夜

（2）按1/50的比例稀释菌液，于250r/min，培养3小时,使其OD600值达到0.6

（3）加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L

（4）继续培养小时

（5）取1.5ml菌液于10000r/min，离心2min，收获菌体

2．目的蛋白的检测

（1）凝胶制备

分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。

先制分离胶，将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约30~40min后凝聚。

将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。

（2）凝胶电泳

取80ml电极缓冲液稀释5倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。

然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。

80V恒压20分钟，120V恒压2小时

（3）染色、脱色

电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色0.5~1小时；

之后，在脱色液中脱色1小时，观察目的蛋白表达情况。

背景知识：

1、载体特点

　　①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；

　　②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；

　　③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；

　　④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。

　　这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。

　　pEGFP-N3载体上携带有EGFP蛋白表达基因。

2、GFP的相关知识

　　绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein，GFP）基因由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。

GFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，但在还原环境下荧光会很快熄灭。

　　与以往常用的报告基因相比，GFP具有以下优点：

　　①在荧光显微镜下，用波长约490nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；

　　②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；

　　③蛋白本身性质稳定；

　　④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；

　　⑤其基因片段长度较小（约717bp），易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。

EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。

EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。

3、重组DNA分子的转化原理：

细菌处于易吸收外源DNA的生理状态叫感受态，转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。

其原理是细菌处于0℃，在有CaCl2存在的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达。

在选择性培养基上进行重组子的鉴定。