发酵工程全重点总结Word格式.docx
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即拮抗作用。
3）.其间1804年，法国厨师阿卑特（Appert）发明了瓶装罐头
③第二个转折点——通气搅拌的好氧发酵工程技术建立（深层液态发酵）：
20世纪40年代，由于二战暴发，刺激了抗生素发酵工业的兴起，成功建立起深层通气培养法及整套工艺，包括向发酵罐内通入大量无菌空气、通过搅拌使空气分布均匀、培养基的灭菌和无菌接种、通氧量、pH、培养物供给等均已解决，刺激了有机酸、酶制剂、维生素、激素等的大规模生产。
1928年，Fleming发现了青霉素，开创了好气性发酵工程，建立了通风搅拌技术。
④第三个转折点——人工诱变育种和代谢控制发酵工程技术的建立：
以动态生物化学和遗传学为基础，将微生物进行人工诱变，选育高产菌株，实现有选择地大量生产目的产物。
该技术先在氨基酸生产上获得成功，而后在核苷酸、有机酸、抗生素等其它产品中得到应用。
7发酵工业的培养方法及过程：
（1）表面培养法是以微生物在基质表面进行培养的方法，根据所用培养基种类的不同，可以分为固体表面发酵和液体表面发酵。
（2）深层培养法是以微生物细胞生长于液体培养基深层中进行培养的方法。
8微生物发酵其本质，可以理解为物质形式的转化过程，就是利用微生物生长所需的底物转化成特定的产物。
在这个过程中，有两个问题是工业化需要解决的：
（1）产物的社会效益，
（2）物质转变过程中产生的经济效益，即：
低价值的原材料、低能耗等。
第二章培养基
1培养基：
是人工配制的供微生物或动植物细胞生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质和原料，同时培养基也为微生物等提供除营养外的其它生长所必须的环境条件。
2适宜于大规模发酵的培养基的共同点：
①培养基能满足产物最经济的合成；
②形成的副产物尽可能的少；
③因地制宜，质优价廉，成本低；
④能满足工艺的总体要求。
3培养基分类基本情况
①按纯度分：
合成培养基、天然培养基②按状态分：
半固体培养基、固体培养基、液体培养基③按用途分：
种子培养基、孢子培养基、发酵培养基。
①合成培养基definedmedium:
所用的原料其化学成分明确、稳定。
适于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等科研工作；
但营养单一，价格较高。
天然培养基complex/undefinedmedium：
所用的原料是一些天然动植物产品。
原料来源丰富、价格低廉，适用于工业生产；
但组分复杂，不易重复，如对原料质量等方面不加控制会影响生产的稳定性。
发酵工业普遍使用天然培养基。
半合成培养基（semi-definedmedium）
②固体培养基solidmedium：
比较适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类。
半固体培养基semi-solidmedium：
主要用于鉴定菌种，观察细菌运动特征及噬菌体的效价滴定等。
在配好的液体培养基中加入少量琼脂（0.5%～0.8%）。
液体培养基liquidmedium：
配有可溶性的或不溶性的营养成分，80%～90%是水，是发酵工业大规模使用的培养基。
③种子培养基seedmedium：
供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。
孢子培养基sporemedium：
制备孢子用的，要求此种培养基既能形成大量的优质孢子，又不引起菌种的变异。
发酵培养基fermentationmedium：
提供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。
4培养基的成分和来源：
氮源（有机氮源、无机氮源）、碳源、水、无机盐与微量元素（磷、钙、镁、硫、铁、氯、钠、钾、钙、锌、钻、锰、铜等）、其他。
（一）碳源：
（最主要的组成）凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素来源的营养物质均称为碳源。
碳源有糖类、脂肪（酸）、有机醇、碳水化合物。
1）在特殊条件下，蛋白质水解产物氨基酸也可作为碳源。
2）菌种不同对不同碳源的利用速度和效率也不同3）葡萄糖是碳源中最易利用的糖，可作为加速微生物生长的一种有效的糖.
（二）氮源：
指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素来源的营养物质。
主要功能：
构成微生物细胞和含氮的代谢产物，当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。
有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子。
无机氮源也称之谓迅速利用的氮源。
微生物对它们的吸收利用一般比有机氮源快。
但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。
生理酸性物质：
经微生物代谢后形成酸性物质的无机氮源，如硫酸铵。
生理碱性物质：
经微生物代谢后形成碱性物质的无机氮源，如硝酸钠。
（三）无机盐与微量元素：
磷核酸和蛋白质的必要成分；
钙钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀，降低了培养基中可溶性磷的含量；
镁离子状态时是许多重要酶的激活剂；
硫含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基；
铁细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分；
氯对一些嗜盐菌需要；
钠、钾、钙离子不参与细胞的组成，但是微生物发酵培养基的必要成分；
锌、钻、锰、铜等微量元素大部分作为酶的辅基和激活剂。
①磷（P）培养基中特别重要的元素，是构成核酸，磷脂的成分，并参与ATP,GTP的能量转移反应。
一般需添加磷酸盐，如KH2PO4,K2HPO4,NaH2PO4,（NH4）2HPO4②硫：
含硫氨基酸（胱氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸）等的组成部分，辅酶的活性基。
一般添加Na2SO4,MgSO4。
③K,Na,Ca虽不参与细胞的组成，却是培养基中的重要成分。
Na与维持细胞的渗透压有关，促使某些酶的产量。
K与渗透压有关，并且是许多酶的激活剂，还可促进糖代谢。
④Ca2+以离子状态控制细胞透性和调节酸度。
CaCO3的作用：
Ca2+对淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶等多种酶活性起到十分重要的稳定和活化作用。
常用CaCO3,CaCl2提供钙，一般不与K2HPO4一起使用。
使用时，CaCO3是单独灭菌，在培养基调到中性后才加入，在酸性培养基中易被分解，失去其缓冲能力。
⑤Mg某些细胞的叶绿素成分，是许多重要酶的激活剂，常用MgSO4，注意在碱性溶液中会生成沉淀。
Fe细胞色素，细胞色素氧化酶，过氧化氢酶的成分，对代谢产物的合成有较大影响。
⑥Cl氯离子不具营养作用，对一些含氯代谢物的发酵，还需加入0.1%KCl补充。
其他一些微量元素，Mn,Zn,Co等，一般不需再加入。
（四）生长因子:
凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子。
包括：
维生素，生物素，嘌呤碱，嘧啶碱，氨基酸等。
维生素，主要是B族维生素的硫胺素，核黄素，泛酸，吡哆素，烟酰胺，叶酸，环己六醇，生物素，多为辅基,辅酶。
发酵工业广泛使用的大多是天然原料，如玉米浆，麦芽汁，豆芽汁，酵母膏等，既是N源，又可提供生长因子。
（五）前体促进剂和抑制剂：
发酵培养基中某些成分的加入不促进微生物的生长，只是有助于调节产物的形成，这些添加的物质包括前体，抑制剂和促进剂。
前体物质指某些化合物加入到发酵培养基中，能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身结构并无多大变化，但产量却因前体的加入有较大提高。
前体加入量可以通过计算确定。
抑制剂加入后会抑制某些代谢途径的进行，使另一途径活跃，从而获得人们所需要的某种代谢产物，或使正常代谢的某一代谢中间物积累。
最初应用于甘油发酵，抗生素工业应用最多。
促进剂指那些既不是营养物，又不是前体，但能提高产量的添加剂，如酶生产中的诱导物或表面活性剂等。
诱导剂能增加细胞的产酶速度，提高产酶量。
但不能从根本上改变细胞原有的蛋白质模板，包括酶的底物，底物类似物，及被转化为诱导物的前体物质。
5、培养基的设计和优化：
（一）培养基的配制原则举例：
发酵生产常采用天然成分的液体培养基。
而且，经常用野生的植物淀粉、甘蔗渣、秸秆，以及乙醇、醋酸等石化产品代替粮食来配制培养基。
（1）.培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）：
即根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。
不同营养类型的微生物，其对营养物的需求差异很大。
如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。
异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质，但有机物的种类需适应所培养菌的特点。
按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同：
细菌：
牛肉膏蛋白胨培养基、LB（Luria-Bertani）放线菌：
高氏一号培养基
真菌：
查氏合成培养基、PDA（Potato-Dextrose-Agar）酵母菌；
麦芽汁
（2）.营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）
●浓度过高——微生物的生长起抑制作用，
浓度过小——不能满足微生物生长的需要。
●碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，故常作为
考察培养基组成时的一个重要指标；
C/N比值=碳源中的碳原子的mol数
氮源中所含的氮原子的mol数
例：
谷氨酸生产中?
C/N＝4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；
C/N＝3/1时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。
●速效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例
●各种金属离子间的比例
用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）
（3）.物理化学条件适宜（条件适宜）
（1）pH:
各类微生物的最适生长pH值各不相同：
细菌：
7.0~8.0放线菌：
7.5~8.5
酵母菌：
3.8~6.0霉菌：
4.0~5.8
在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的初始pH值会发生改变，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：
内源调节：
在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；
调节培养基的碳氮比。
外源调节：
按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液
（4）.根据培养基的应用目的选择原料及其来源（经济节约）
该培养基的应用目的，即：
是培养菌体还是积累代谢产物？
是实验室种子培养还是大规模发酵？
代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？
☆用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）；
☆用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）；
若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定代谢产物的前体物；
☆当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉的原料，提倡以粗代精，以废代好。
（二）影响培养基质量的因素1、原料和设备的预处2原材料质量3、发酵特性变化4灭菌
第三章：
灭菌和除菌
1、灭菌：
杀死一切微生物，包括芽孢。
分为杀菌：
菌体尚存和溶菌：
菌体消失
消毒：
只杀死病源菌，未伤及芽孢
防腐：
暂时抑制微生物生长
除菌：
用冲洗、过滤等法，除去微生物
是保证生产成功的重要手段
2、灭菌的方法：
可分为化学灭菌和物理灭菌
（1）化学灭菌：
利用化学药剂杀灭或抑制微生物的方法。
根据浓度，可分为抑菌剂、消毒剂、灭菌剂；
根据状态，可分为液态（喷雾、浸泡、洗刷等），气态（加热、焚烧、氧化等）。
（一）气雾消毒灭菌法：
要求密闭条件下保持一定时间；
种类：
甲醛和气雾盒
①甲醛有刺激性和腐蚀性。
机理：
结合蛋白质氨基，使其变性。
用法：
喷：
5%熏：
10ml/m3+1/2KMnO4
②气雾消毒盒特点：
粉末状、刺激性小、扩散力及渗透性强
2~6g/m3→点燃（熏30min以上）
（二）液体消毒法：
①概念固体或液体药品加水配成药液（多现配现用）
种类：
氧化剂、表面活性剂（乙醇、酚类、新洁尔灭）、熟石灰
常用灭菌剂及有效浓度：
新洁尔灭（苯扎溴铵）0.25%甲醛37%
杜灭芬0.25%戊二醛2%高锰酸钾0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15%
漂白粉5%过氧乙酸0.02%-0.2%酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%
煤酚皂（来苏尔）1%—5%
②药品及浓度的选择依据：
微生物特点、物品的性质、消毒目的、环境影响
药品标准：
性质稳定、易溶于水、杀菌力强、抗菌谱广、作用较快、使用浓度低、价格低廉、没有毒腐性或很小。
（2）物理灭菌
（一）辐射灭菌法：
利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。
包括高频灭菌法、放射线灭菌法、紫外线灭菌法
电离辐射
（1）α射线:
电离辐射强，穿透力差（缺乏穿透力，不实用）
（2）β射线:
电离辐射强，穿透力强
（3）γ射线:
电离辐射弱，穿透力强
（4）X射线：
杀菌力不如紫外线，穿透力强
用途：
忌热物品的灭菌消毒、食品保藏和育种等方面
杀菌机制：
射线使水电离为H＋和OH－，这些游离基是强烈的还原剂
和氧化剂，可直接作用于细菌本身。
杀菌机理直接：
使蛋白质、酶等变性失活
间接：
空气中产生臭氧或过氧化氢
使用：
有效距离：
1.5~2.0m理想波长：
265nm30w紫外灯照30min→避光30min
（二）干热灭菌：
利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解
质浓缩作用而杀灭微生物。
常用方法：
灼烧和电热箱加热，140-180℃1-2h。
焚烧：
废弃物、尸体灼烧：
接种环、试管口干烤：
玻璃器皿红外线：
医疗器械
（三）湿热灭菌：
高压蒸气灭菌法、流通蒸气灭菌法、间歇灭菌法、煮沸灭菌法
利用饱和水蒸气进行灭菌。
蒸汽有很强的穿远力，而且在冷凝时放出大量冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀灭各种微生物。
（四）过滤除菌:
利用适当的过滤装置，通过过滤除去微生物的一种方法。
通常使用的过滤装置有膜过滤器，磁制过虑器、玻璃纤维过虑器等。
0.01~0.45微米孔径滤膜，用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。
3、培养基灭菌
（1）实验室种子培养基灭菌:
使用高压蒸汽灭菌锅。
手提式灭菌锅，容量小。
立式或卧式灭菌锅，容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶。
灭菌柜。
要和蒸汽锅炉配套，用于大量种瓶培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶（袋）。
（2）发酵培养基灭菌
分批灭菌（实罐灭菌、实消灭菌batchsterilization）：
将配制好的培养基输入发酵罐内，用直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间，在冷却至发酵要求的温度。
连续灭菌（连消灭菌continuoussterilization）：
培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后进入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。
（3）分批灭菌操作过程:
空罐准备：
清洗、检修和检测。
升温：
把培养基加热到灭菌所需的温度。
保温维持：
在灭菌温度下保持灭菌所需时间。
冷却保压：
把培养基的温度降低到接种的温度。
（4）分批灭菌设备示意图
三路进汽：
直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维
持一定的时间。
这就是所谓的“三路进气”。
四路出汽：
直接蒸汽从排气、接种、进料、消沫剂管排气。
（5）连续灭菌流程：
培养基配料、配料罐、加热器、维持罐、冷却器、无菌培养基
（6）分批灭菌优点：
1．不需附加设备2．蒸汽利用率高3．节约劳动力缺点1．培养基质量比较差2．罐的利用率低3.冷却水用量大。
连续灭菌优点：
1。
采用高温快速灭菌法2．可以把培养基按其性质分开灭菌3．有利于自动控制4．节省冷却水。
缺点1．投资费用高2．对物料要求高3．蒸汽用量大
（7）高温对培养基的有害影响：
消除高温有害影响的措施①采用特殊加热灭菌法（连续灭菌方法）②对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；
③对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；
④对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌。
4.发酵罐灭菌：
培养基的灭菌如果采用分批灭菌，发酵罐与培养基一起灭菌。
培养基用连续灭菌时，发酵罐在注入培养基前先行单独灭菌。
5.空气除菌：
①空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母，霉菌孢子
和病毒。
这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气
中微生物的含量一般为103~104个／米3。
灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒（0.6-1μm）
无菌空气的标准百分数：
99.99％
美国联邦宇航局等级标准：
100级（直径小于0.5微米粒子数少于3.5个/L）
温度：
25℃—40℃湿度：
30%—45%
②主要有：
加热、静电和介质过滤三种方法。
③两级分离、冷却、加热的空气除菌流程：
粗过滤器、压缩机、贮罐、冷却器、丝网分离器、过滤器。
④膜过滤（绝对过滤）利用微孔滤膜对空气进行过滤，膜的孔径0.2-0.45微米，大于这一
孔径的微生物能绝对截留。
膜过滤器：
聚四氟乙烯、偏聚二氟乙烯、、聚丙烯、纤维素脂膜等
氨基酸生产方法：
1、蛋白水解法：
①酸水解：
盐水、硫酸，110-120℃，12-24h；
缺点氨基酸结构被破坏，污染环境。
②碱水解：
氢氧化钠、氢氧化钡，100℃，6h；
缺点氨基酸结构被破坏，消旋。
③酶水解缺点水解不彻底，可用于生产肽、胨等。
2、化学合成法：
丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。
化学合成法借助于有机合成及化学工程相结合的技术生产氨基酸的一种方法。
虽然化学合成法可以生产目前已知的所有氨基酸，但多数不具备工业价值，原因是应用化学生产的氨基酸含有D和L两种旋光异构体（手性异构体），其中的D-异构体不能被大多数动物所利用。
因此，用化学合成法生产氨基酸时除考虑合成工艺条件外，还要考虑异构体属性问题和D-异构体的消旋利用，三者缺一都影响氨基酸的利用。
在氨基酸工业中应用化学合成法批量生产的氨基酸仅限于甘氨酸、蛋氨酸和色氨酸。
其中，甘氨酸是应用化学合成法生产的最理想的品种，因为甘氨酸没有旋光异构体。
DL混合型蛋氨酸及色氨酸能为畜禽利用，因此也具有一定价值。
3、酶法：
利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。
应用此法批量生产的氨基酸有赖氨酸、L-胱氨酸。
4、发酵法：
发酵法生产氨基酸是利用微生物具有的能够合成其自身所需的各种氨基酸能力，通过对菌株的诱变等处理，选育出各种缺陷型及抗性的变异菌株，以解除代谢节中的反馈与阻遏，达到以过量合成某种氨基酸为目的的一种氨基酸生产方法。
应用发酵法生产氨基酸产量最大的是谷氨酸，基次是赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸。
另外，色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸等也可由发酵法获得，但因生产水平低，尚不具备实用价值。
生产菌株一般是各种营养缺陷型的黄色短杆菌。
微生物细胞内氨基酸的生物合成都是利用能量代谢过程中衍生的一些中间代谢产物为起点，经过一系列伴随着自由能损失的不可逆反应，来保证各种氨基酸的不断供应。
第四章菌种选育、制备与保藏
第一节微生物的特性及工业微生物的要求
一、工业生产常用的微生物
１、细菌（bacteria）：
–短杆菌：
GA、Gln、lys……–枯草芽孢杆菌：
淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等–地衣芽孢杆菌：
HASS（耐高温α-淀粉酶）α-Amylase–苏云金芽孢杆菌：
BT生物农药……–梭状芽孢杆菌：
丙酮、丁酸等的发酵
２、酵母菌（yeast）:
–啤酒酵母：
酿酒酵母、辅酶类物质的发酵–酒精酵母：
–汉逊酵母：
食品工业，用于乙酸乙酯的发酵–假丝酵母：
scp生产，石油发酵
３、霉菌（mould）：
–黑曲霉：
柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、酶制剂工业（糖化酶）–黄曲霉：
酱油生产（3042），面酱–青霉菌：
青霉素的生产–红曲霉：
红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；
使用红色色素的生产；
豆腐乳的生产等。
–赤霉菌：
赤霉素的生产（一种植物生长激素）。
４、放线菌（antinomycetes）：
–最大的经济价值在于能生产多种抗生素。
５、担子菌（basidiomycetes）：
６、藻类（alga）：
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，有６０％以上是放线菌生产的。
二、工业化菌种的要求:
（1）廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。
（2）易于控制培养条件，酶活性高。
发酵周期较短。
（3）抗杂菌和噬菌体的能力强。
（4）菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。
（5）产品容易分离提纯。
第二节工业微生物菌种的选育
菌种选育的目的：
1、提高发酵单位或产量2、改进产品质量3、去除多余的产物5、抗生素合成基因表达4、产生新抗生素
一、自然育种
从自然界分离获得菌种，根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。
从自然界中分离筛选菌种的方法步骤：
1采样（方法、地点、时间和周围环境记录）2增殖培养3纯种分离（纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：
1．稀释分离法2．平板划线分离法⑴涂菌：
⑵划线分离：
①分步划线法；
②一次划线法：
3．组织分离法）4纯培养
5生产性能测定（测定代谢产物或其它目的性状）
从自发突变体中获得菌株
自然状态下，碱基对
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