第五章凝胶过滤层析.ppt

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第五章凝胶过滤层析,第五章凝胶过滤层析第一节概述,凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography,GF或GFC）是20世纪50年代前后发展起来的一种按分子大小进行分离的纯化手段。

在众多分离计划中被广泛采用，不同的文献中采用了多种不同的称谓:

凝胶层析（gelchromatography）排阻层析（exclusionchromatography）分子筛层析（molecularsievingchromatography）立体排阻层析（stericexclusionchromatography）体积排阻层析（sizeexclusionchromatography,SEC）,第五章凝胶过滤层析第一节概述,凝胶过滤具有的优势:

（1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温和，回收率高，重现性好；

（2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能在不同pH、温度下进行；（3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、核酸等大分子物质的纯化；（4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时层析介质不需再生即可反复使用。

第五章凝胶过滤层析第二节原理,一、凝胶过滤的概念不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同,凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.,第五章凝胶过滤层析第二节原理,凝胶色谱分离原理,第五章凝胶过滤层析第二节原理,凝胶过滤分离蛋白质的过程

（1）蛋白质混合物上柱；

（2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在颗粒外；（3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的分子开始分开；（4）大小不同的分子完全分开；（5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。

第五章凝胶过滤层析第二节原理,二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范围是凝胶介质的重要参数。

根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类：

1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；,第五章凝胶过滤层析第二节原理,2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也最长，最后从层析柱中被洗脱；3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质的有效分离对象。

如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。

第五章凝胶过滤层析第二节原理,在生物大分子的分离中，决定该分子在层析时的保留时间长短即洗脱快慢的因素不仅仅是相对分子质量，分子形状的影响也很大。

有着相同分子量，但是形状不同的分子，其保留时间不同。

一般来说，分子量相同情况下，不对称程度增加会使分子更容易被阻挡在凝胶颗粒的网孔之外，导致保留时间变短。

第五章凝胶过滤层析第二节原理,三、凝胶过滤的有关理论问题凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的颗粒。

凝胶柱的体积参数包括：

总柱床体积（totalvolume,Vt），是凝胶经溶胀、装柱、沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积；外水体积（outervolume,V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液相体积的总和；内水体积（innervolume,Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗粒网孔中的液相体积的总和；凝胶体积（gelvolume,Vg），又称支持物基质体积（matrixvolumeofthesupport,Vs）或干胶体积，是凝胶颗粒固相所占据的体积，,第五章凝胶过滤层析第二节原理,根据凝胶床的组成，总柱床体积等于外水体积、内水体积与凝胶体积之和：

Vt=V0+Vi+Vg,凝胶柱体积参数示意图,第五章凝胶过滤层析第二节原理,洗脱体积和分配系数洗脱体积Ve定义为自样品加至层析柱上部开始，至洗脱组分达到最大浓度（对映洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗脱液的体积.,第五章凝胶过滤层析第二节原理,凝胶过滤洗脱曲线示意图（组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）,第五章凝胶过滤层析第二节原理,所示层析图谱中，样品由三种组分组成。

组分A为全排阻分子，分子量大于凝胶分级范围上限，不能进入凝胶网孔，经凝胶颗粒间隙被洗脱，该组分的洗脱体积Ve等于外水体积V0（Ve=V0）。

组分C为全渗透分子，分子量小于凝胶分级范围下限，完全渗透进入凝胶网孔内，在正常洗脱条件下，与凝胶间不存在吸附作用时，此类组分的洗脱体积是最大的，等于外水体积V0与内水体积Vi之和（Ve=V0+Vi）。

组分B为部分渗透分子，分子量处于凝胶分级范围内，是此类凝胶能有效分离的物质。

根据组分B的分子量，该组分能以一定程度进入凝胶网孔之中，其洗脱体积Ve处于组分A与组分C之间（V0VeV0+Vi）。

第五章凝胶过滤层析第二节原理,凝胶过滤层析是一种分配过程，凝胶颗粒内部吸附的溶剂为固定相，流经层析柱的洗脱剂为流动相，样品的洗脱过程就是溶质分子在两相中不断分配平衡的过程，而某种物质的洗脱体积Ve的大小取决于该物质在流动相和固定相之间的分配系数Kd，其关系式为：

Ve=V0+KdViKd的值与被分离物质的分子量和分子形状、凝胶颗粒间隙和网孔大小有关，与层析柱的长短、粗细无关。

第五章凝胶过滤层析第二节原理,对所有全排阻分子，由于Ve相同，凝胶过滤层析时两两之间无法实现分离，对所有全渗透分子同样如此。

如两种物质都是部分渗透分子但分子大小不同，其Kd值不同因而Ve也不同，可实现分离，这种部分渗透分子之间的分离称为分级分离。

而不同类别分子之间，即在上图中组分A与组分B，或组分A与组分C，或组分B与组分C之间的分离称为组别分离。

第五章凝胶过滤层析第二节原理,当凝胶与被分离组分存在相互作用的情况下会出现Kd1的情况。

这种相互作用包括：

（1）疏水作用

（2）亲和作用（3）离子间的静电作用,第五章凝胶过滤层析第二节原理,凝胶过滤的分辨率层析分离常采用分辨率（RS）来描述两种物质之间分离效果的好坏。

分辨率定义为两个洗脱峰峰顶对映的洗脱体积之差比上两峰在基线上峰宽的和的平均值。

式中，Ve1和Ve2洗脱峰1和峰2的洗脱体积；Wb1和Wb2洗脱峰1和峰2的峰宽。

RS是相邻两个洗脱峰相对分离程度的衡量标准。

第五章凝胶过滤层析第二节原理,分辨率Rs的定义,第五章凝胶过滤层析第二节原理,分离两种物质时分辨率取决于这两种组分的洗脱体积和峰宽。

而决定组分洗脱体积和峰宽的因素包括两种组分的分子大小，凝胶柱的选择性和柱效。

选择性是一个系统分离大小不同组分的能力，习惯用相对保留值来表示，定义为：

=（Ve2V0）/（Ve1V0）Ve1和Ve2组分1和组分2的洗脱体积；V0层析柱的外水体积。

第五章凝胶过滤层析第二节原理,柱效用在特定实验条件下层析柱的理论塔板数N来表示通常表示为每米层析床所包含的理论塔板数，其计算公式：

Ve组分的洗脱体积；Wh洗脱峰半峰高（h1/2）时对映的峰宽。

柱效还可用一个理论塔板的高度H来表示：

HL/N式中L为柱长。

凝胶过滤时柱效的好坏取决于层析柱的填充效果，凝胶颗粒的尺寸，柱长，流速等因素，良好的装柱操作，较细的介质，较长的层析柱都有利于提高柱效。

第五章凝胶过滤层析第三节凝胶过滤介质,一、凝胶过滤介质的基本结构凝胶介质的基本结构都是具有多孔网状结构的水不溶性多聚物。

理想的凝胶过滤介质必须符合以下条件：

（1）有较强的机械稳定性，能满足层析过程所需流速，在其标称的操作压力范围内不发生体积变化；

（2）高化学稳定性，凝胶颗粒对分离过程中常用的试剂和样品都保持惰性，在很宽的pH范围内保持稳定，耐去污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便清洗和消毒灭菌；（3）球形，颗粒直径均匀，呈现亲水性；（4）不带电荷，不对样品产生吸附作用。

复习,一、凝胶过滤的概念不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同,凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.,复习,凝胶色谱分离原理,复习,凝胶过滤分离蛋白质的过程

（1）蛋白质混合物上柱；

（2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在颗粒外；（3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的分子开始分开；（4）大小不同的分子完全分开；（5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。

复习,根据凝胶床的组成，总柱床体积等于外水体积、内水体积与凝胶体积之和：

Vt=V0+Vi+Vg,凝胶柱体积参数示意图,复习,凝胶过滤洗脱曲线示意图（组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）,洗脱体积Ve定义为自样品加至层析柱上部开始，至洗脱组分达到最大浓度（对映洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗脱液的体积.,复习,分配系数Kd凝胶过滤层析是一种分配过程，样品的洗脱过程就是溶质分子在两相中不断分配平衡的过程，而某种物质的洗脱体积Ve的大小取决于该物质在流动相和固定相之间的分配系数Kd，其关系式为：

Ve=V0+KdViKd的值与被分离物质的分子量和分子形状、凝胶颗粒间隙和网孔大小有关，与层析柱的长短、粗细无关。

复习,凝胶过滤的分辨率,复习,凝胶柱的选择性和柱效选择性是一个系统分离大小不同组分的能力，习惯用相对保留值来表示，定义为：

=（Ve2V0）/（Ve1V0）柱效用在特定实验条件下层析柱的理论塔板数N来表示通常表示为每米层析床所包含的理论塔板数，其计算公式：

复习,理想的凝胶过滤介质必须符合以下条件：

（1）有较强的机械稳定性，

（2）高化学稳定性，（3）球形，颗粒直径均匀，呈现亲水性；（4）不带电荷，不对样品产生吸附作用。

第五章凝胶过滤层析第三节凝胶过滤介质,二、凝胶过滤介质的参数及性质粒度凝胶介质的粒度是指溶胀后的凝胶水化颗粒的大小，单位是微米（m）.粒度越小，分离效果越好，但能分离样品量减少，限制了流速的提高，对层析设备的要求提高，因此细颗粒介质适用于分析型分离；凝胶颗粒越大，柱效会下降，但可分离样品量提高，背景压力减小，因此大颗粒介质适合于中小规模的制备型分离。

第五章凝胶过滤层析第三节凝胶过滤介质,交联度和网孔结构凝胶介质是具有三维网孔结构的颗粒，网孔结构是交联剂将相邻的链状分子相互连接而成的（琼脂糖凝胶Sepharose除外）.交联剂的用量决定凝胶颗粒的交联度.交联度决定了凝胶的分级范围。

第五章凝胶过滤层析第三节凝胶过滤介质,机械强度作为凝胶过滤层析介质，具有一定的机械强度是必要条件,在层析操作时，层析柱承受的压力降和所采用的流速规定了介质必须具备的机械强度。

作为商品凝胶，其机械强度一般采用可承受操作压力范围（MPa）或最大线性流速（cm/h）来表示。

第五章凝胶过滤层析第三节凝胶过滤介质,物理和化学稳定性在物理稳定性方面，人们关心的是介质能够承受高温高压的情况。

化学稳定性包含的内容较多,首先是pH稳定性,还有用酸或碱的稳定性.,第五章凝胶过滤层析第三节凝胶过滤介质,三、凝胶过滤介质的主要类型按基质组成主要可以分为葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯-二乙烯苯凝胶、二氧化硅凝胶，以及由两种物质混合形成的如葡聚糖-琼脂糖混合凝胶、琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等。

按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率，又可以将凝胶分为标准凝胶介质和高效凝胶介质。

第五章凝胶过滤层析第三节凝胶过滤介质,葡聚糖凝胶Sephadex称为交联葡聚糖凝胶，是最早问世且至今仍被广泛使用的凝胶过滤介质，Sephadex是其商品名。

Seph