必备蛋白质的结构分析流程教程Word下载.docx
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实验数据
许多实验数据可以辅助结构预测过程，包括：
•二硫键，固定了半胱氨酸的空间位置
•光谱数据，可以提供蛋白的二级结构内容
•定位突变研究，可以发现活性或结合位点的残基
•蛋白酶切割位点，翻译后修饰如磷酸化或糖基化提示了残基必须是暴露的
•其他
预测时，必须清楚所有的数据。
必须时刻考虑：
预测与实验结果是否一致？
如果不是，就有必要修改做法。
蛋白序列数据
对蛋白序列的初步分析有一定价值。
例如，如果蛋白是直接来自基因预测，就可能包含多个结构域。
更严重的是，可能会包含不太可能是球形或可溶性的区域。
此流程图假设你的蛋白是可溶的，可能是一个结构域并不包含非球形结构域。
需要考虑以下方面：
•是跨膜蛋白或者包含跨膜片段吗？
有许多方法预测这些片段，包括：
oTMAP（EMBL）
oPredictProtein（EMBL/Columbia）
oTMHMM（CBS,Denmark）
oTMpred（BaylorCollege）
oDAS（Stockholm）
•如果包含卷曲（coiled-coils）可以在COILSserver预测coiledcoils或者下载COILS程序（最近已经重写，注意GCG程序包里包含了COILS的一个版本）
•蛋白包含低复杂性区域？
蛋白经常含有数个聚谷氨酸或聚丝氨酸区，这些地方不容易预测。
可以用SEG（GCG程序包里包含了一个版本的SEG程序）检查。
如果出现以上一种情况，就应该将序列打成碎片，或忽略序列中的特定区段，等等。
这个问题与细胞定位结构域相关。
搜索序列数据库
分析任何新序列的第一步显然是搜索序列数据库以发现同源序列。
这样的搜索可以在任何地方或者在任何计算机上完成。
而且，有许多WEB服务器可以进行此类搜索，可以输入或粘贴序列到服务器上并交互式地接收结果。
序列搜索也有许多方法，目前最有名的是BLAST程序。
可以容易得到在本地运行的版本（从NCBI或者WashingtonUniversity），也有许多的WEB页面允许对多基因或蛋白质序列的数据库比较蛋白质或DNA序列，仅举几个例子：
•NationalCenterforBiotechnologyInformation（USA）Searches
•EuropeanBioinformaticsInstitute（UK）Searches
•BLASTsearchthroughSBASE（domaindatabase;
ICGEB,Trieste）
•还有更多的站点
最近序列比较的重要进展是发展了gappedBLAST和PSI-BLAST（positionspecificinteratedBLAST），二者均使BLAST更敏感，后者通过选取一条搜索结果，建立模式（profile），然后用再它搜索数据库寻找其他同源序列（这个过程可以一直重复到发现不了新的序列为止），可以探测进化距离非常远的同源序列。
很重要的一点是，在利用下面章节方法之前，通过PSI-BLAST把蛋白质序列和数据库比较，找寻是否有已知结构。
将一条序列和数据库比较的其他方法有：
•FASTA软件包（WilliamPearson,UniversityofVirginia,USA）
•SCANPS（GeoffBarton,EuropeanBioinformaticsInstitute,UK）
•BLITZ（Compugen'
sfastSmithWatermansearch）
•其他方法.
Itisalsopossibletousemultiplesequenceinformationtoperformmoresensitivesearches.Essentiallythisinvolvesbuildingaprofilefromsomekindofmultiplesequencealignment.Aprofileessentiallygivesascoreforeachtypeofaminoacidateachpositioninthesequence,andgenerallymakessearchesmoresentive.Toolsfordoingthisinclude:
•PSI-BLAST（NCBI,Washington）
•ProfileScanServer（ISREC,Geneva）
•HMMER隐马氏模型（SeanEddy，WashingtonUniversity）
•Wisepackage（EwanBirney，SangerCentre；
用于蛋白质对DNA的比较）
AdifferentapproachforincorporatingmultiplesequenceinformationintoadatabasesearchistouseaMOTIF.Insteadofgivingeveryaminoacidsomekindofscoreateverypositioninanalignment,amotifignoresallbutthemostinvariantpositionsinanalignment,andjustdescribesthekeyresiduesthatareconservedanddefinethefamily.Sometimesthisiscalleda"
signature"
.Forexample,"
H--x--x-G-x（5）--H-x（3）-"
describesafamilyofDNAbindingproteins.Itcanbetranslatedas"
histidine,followedbyeitheraphenylalanineortryptophan,followedbyanaminoacid（x）,followedbyleucine,isoleucine,valineormethionine,followedbyanyaminoacid（x）,followedbyglycine,..."
.
PROSITE（ExPASyGeneva）containsahugenumberofsuchpatterns,andseveralsitesallowyoutosearchthesedata:
•ExPASy
•EBI
Itisbesttosearchafewdifferentdatabasesinordertofindasmanyhomologuesaspossible.Averyimportantthingtodo,andonewhichissometimesoverlooked,istocompareanynewsequencetoadatabaseofsequencesforwhich3Dstructureinformationisavailable.Whetherornotyoursequenceishomologoustoaproteinofknown3Dstructureisnotobviousintheoutputfrommanysearchesoflargesequencedatabases.Moreover,ifthehomologyisweak,thesimilaritymaynotbeapparentatallduringthesearchthroughalargerdatabase.
Onelastthingtorememberisthatonecansavealotoftimebymakinguseofpre-preparedproteinalignments.Manyofthesealignmentsarehandeditedbyexpertsontheparticularproteinfamilies,andthusrepresentprobablythebestalignmentonecangetgiventhedatatheycontain（i.e.theyarenotalwaysasuptodateasthemostrecentsequencedatabases）.Thesedatabasesinclude:
•SMART（Oxford/EMBL）
•PFAM（SangerCentre/Wash-U/KarolinskaIntitutet）
•COGS（NCBI）
•PRINTS（UCL/Manchester）
•BLOCKS（FredHutchinsonCancerResearchCentre,Seatle）
•SBASE（ICGEB,Trieste）
通常把蛋白质序列和数据比较都有很多的方法，这些对于识别结构域非常有用。
确定结构域
Ifyouhaveasequenceofmorethanabout500aminoacids,youcanbenearlycertainthatitwillbedividedintodiscretefunctionaldomains.Ifpossible,itispreferabletosplitsuchlargeproteinsupandconsidereachdomainseparately.Youcanpredictthelocatationofdomainsinafewdifferentways.Themethodsbelowaregiven（approximately）frommosttoleastconfident.
•
Ifhomologytoothersequencesoccursonlyoveraportionoftheprobesequenceandtheothersequencesarewhole（i.e.notpartialsequences）,thenthisprovidesthestrongestevidencefordomainstructure.Youcaneitherdodatabasesearchesyourselformakeuseofwell-curated,pre-defineddatabasesofproteindomains.Searchesofthesedatabases（seelinksbelow）willoftenassigndomainseasily.
o
SMART（Oxford/EMBL）
PFAM（SangerCentre/Wash-U/KarolinskaIntitutet）
COGS（NCBI）
PRINTS（UCL/Manchester）
BLOCKS（FredHutchinsonCancerResearchCentre,Seatle）
SBASE（ICGEB,Trieste）
YoucanalsofinddomaindescriptionsintheannotationsinSWISSPROT.
Regionsoflow-complexityoftenseparatedomainsinmultidomainproteins.Longstretchesofrepeatedresidues,particularlyProline,Glutamine,SerineorThreonineoftenindicatelinkersequencesandareusuallyagoodplacetosplitproteinsintodomains.
LowcomplexityregionscanbedefinedusingtheprogramSEGwhichisgenerallyavailableinmostBLASTdistributionsorwebservers（aversionofSEGisalsocontainedwithintheGCGsuiteofprograms）.
Transmembranesegmentsarealsoverygooddividingpoints,sincetheycaneasilyseparateextracellularfromintracellulardomains.Therearemanymethodsforpredictingthesesegments,including:
TMAP（EMBL）
PredictProtein（EMBL/Columbia）
TMHMM（CBS,Denmark）
TMpred（BaylorCollege）
DAS（Stockholm）
Somethingelsetoconsiderarethepresenceofcoiled-coils.Theseunusualstructuralfeaturessometimes（butnotalways）indicatewhereproteinscanbedividedintodomains.YoucanpredictcoiledcoilsattheCOILSserveroryoucandownloadtheCOILSprogram（recentlyre-writtenbymeofallpeople;
aversionofSEGisalsocontainedwithintheGCGsuiteofprograms）.
Secondarystructurepredictionmethods（seebelow）willoftenpredictregionsofproteinstohavedifferentproteinstructuralclasses.Forexampleoneregionofsequencemaybepredictedtocontainonlylphahelicesandanothertocontainonlybetasheets.Thesecanoften,thoughnotalways,suggestlikelydomainstructure（e.g.anallalphadomainandanallbetadomain）
Ifyouhaveseparatedasequenceintodomains,thenitisveryimportanttorepeatallthedatabasesearchesandalignmentsusingthedomainsseparately.Searcheswithsequencescontainingseveraldomainsmaynotfindallsub-homologies,particularlyifthedomainsareabundentinthedatabase（e.g.kinases,SH2domains,etc.）.Theremayalsobe"
hidden"
domains.Forexampleifthereisastretchof80aminoacidswithfewhomologuesnestedinbetweenakinaseandanSH2domain,thenyoumaymissmatchesfoundwhensearchingthewholesequenceagainstadatabase.
Anyway,hereismyslidefromthetalkrelatedtothissubject:
多序列比对
Regardlessoftheoutcomeofyoursearches,youwillwantamultiplesequencealignmentcontainingyoursequenceandallthehomologuesyouhavefoundabove.
Somesitesforperformingmultiplealignment:
EBI（UK）ClustalwServer
IBCP（France）MultalinServer
IBCP（France）ClustalwServer
IBCP（France）CombinedMultalin/Clustalw
MSA（USA）Server
BCMMultipleSequenceAlignmentClustalWSever（USA）
Ifyouaregoingtodoalotofalignments,thenitisprobablybesttogetyourowncopyofoneofmanyprograms,someFTPsitesforsomeoftheseare:
HMMer（HMMmethod,WashU）
SAM（HMMmethod,SantaCruz）
ClustalW（EBI,UK）
ClustalW（USA）
MSA（USA）
AMPS（UK）
NotethatPileUpiscontainedwithintheGCGcommercialpackage.Mostinstitutionswithpeopledoingthissortofworkwillhaveaccesstothissoftware,soaskaroundifyouwanttouseit.
ProbablythemostimportantadvancesincethesepagesfirstappearedareHiddenMarkovModelsforsequencealignment.Severalmethodsarelistedabove.
Alignmentscanprovide:
Informationastoproteindomainstructure
Thelocationofresidueslikelytobeinvolvedinproteinfunction
Informationofresidueslikelytobeburiedintheproteincoreorexposedtosolvent
Moreinformationthanasinglesequenceforapplicationslikehomologymodellingandsecondarystructureprediction.
Sometips
Don'
tjusttakeeverythingfoundinthesearchesandfeedthemdirectlyintothealignmentprogram.Searcheswillalmostalwaysreturnmatchesthatdonotindicateasignificantsequencesimilarity.Lookthroughtheoutputcarefullyandthrowthingsoutiftheydon'
tappeartobeamemberofthesequencefamily.Inclusionofnon-membersinyouralignmentwillconfusethingsandlikelyleadtoerrorslater.
Rememberthattheprogramsforaligningsequencesaren'
tperfect,anddonotalwaysprovidethebestalignment.Thisisparticularlysoforlargefamiliesofproteinswithlowsequenceidentities.Ifyoucanseeabetterwayof
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