生物工艺学知识点Word格式.docx
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5、菌种的衰退表观现象有哪些？
目的产物的产量下降
营养物质代谢和生长繁殖能力下降
发酵周期延长
抗不良环境的性能减弱
6、菌种的衰退的原因
菌种保藏不当
提供不了当的条件或不利的条件
经诱变得到的新菌株发生回复突变
7、菌种的复壮方法：
纯种分离
通过寄主体进行复壮
淘汰已衰退的个体
8、菌种的保藏的原理
根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。
一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。
9、菌种的保藏方法：
A斜面冰箱保藏法
B沙土管保藏法
C石蜡油封存法
D真空冷冻干燥保藏法
E液氮超低温保藏法
第三章菌种选育
1、常用菌种选育方法
（1）自然选育:
是指在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变（spontaneousmutation）而进行菌种筛选的过程。
自发突变的频率较低，变异程度不大。
所以该法培育新菌种的过程十分缓慢。
（2）诱变育种:
是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究使用。
诱变育种的理论基础是基因突变。
常用诱变剂：
物理诱变剂、化学诱变剂（碱基类似物、与碱基反应的物质、在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基物质）、生物诱变剂
（3）分子育种（DNA重组、基因工程）：
用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
（4）杂交育种（Hybridization）：
常规杂交育种（Hybridization）：
一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖或原核微生物的接合、F因子转移、转导和转化等过程，促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。
原生质体融合技术：
通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦称为“细胞融合”（cellfusion）。
原生质体融合的基本过程：
原生质体形成、原生质体融合、原生质体的再生。
3、工程菌的不稳定性表现
质粒的不稳定（质粒的丢失、重组质粒的DNA片段脱落）、表达产物的不稳定
第三章微生物的代谢调节
1、微生物代谢调节方式
代谢流向的调控分为代谢物的合成和代谢物的降解；
通过快速启动蛋白质的合成和有关的代谢途径，平衡各代谢物流和反应速率来适应外界环境的变化。
代谢速度的调控分为酶量（粗调）（酶合成的诱导和酶合成的阻遏）和酶活（细调）（酶活性的激活、酶活性的抑制）
反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢；
影响催化一系列反应的多个酶
反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。
只对是一系列反应中的第一个酶起作用
底物对酶的影响称为前馈。
产物对酶的影响称为反馈。
2、微生物初级代谢调节包括酶活调节、酶合成调节、遗传控制
（1）酶活性的调节（细调）：
一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。
酶活调节的影响因素包括：
底物和产物的性质和浓度、压力、pH、离子强度、辅助因子以及其他酶的存在等等。
特点是反应快速。
酶活性的调节包括：
酶活性的激活和酶活性的抑制（反馈抑制）
（2）酶合成的调节：
通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。
这类调节在基因转录水平上进行，对代谢活动的调节是间接的、缓慢的
（3）酶合成的阻遏：
在某代谢途径中，当末端产物过量时，微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢，减少末端产物生成，这种现象称为酶合成的阻遏。
末端代谢产物阻遏:
由于某代谢途径末端产物的过量积累而引起酶合成的（反馈）阻遏。
分解代谢物阻遏：
当细胞内同时存在两种可利用底物（碳源或氮源）时，利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。
这种阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的，所以称为分解代谢物阻遏（过去被称为葡萄糖效应）。
3、改变细胞膜通透性的方法
A限制培养基中生物素浓度在1～5mg/L，控制细胞膜中脂质的合成；
B加入青霉素，抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联；
C加入表面活性剂如吐温80或阳离子表面活性剂（如聚氧化乙酰硬脂酰胺），将脂类从细胞壁中溶解出来，使细胞壁疏松，通透性增加；
D控制Mn2+、Zn2+的浓度，干扰细胞膜或细胞壁的形成；
E可以通过诱变育种的方法，筛选细胞透性突变株。
5、人工控制微生物代谢的两种手段：
（1）生物合成途径的遗传控制
（2）发酵条件的控制
6.谷氨酸棒杆菌（生物素缺陷型）生产谷氨酸的调控
第四章微生物次级代谢与调节
1、次级代谢产物：
某些微生物在生命循环的某一个阶段产生的物质，它们一般是在菌生长终止后合成的。
其生物合成至少有一部分是与核内和核外的遗传物质有关，同时也与这类遗传信息产生的酶所控制的代谢途径有关。
微生物产生的次级代谢物有抗生素、毒素、色素和生物碱等。
2、初级与次级代谢途径相互连接次级代谢物通常是由初级代谢中间体经修饰后形成的
修饰初级代谢中间体的三种生化过程生物氧化与还原、生物甲基化、生物卤化
3、前体：
指加入到发酵培养基中的某些化合物，它能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化有些还具有促进产物合成的作用。
中间体是指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，他们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。
4、次级代谢物生物合成的原理
①一旦前体被合成，在适当条件下它们便流向次级代谢物生物合成的专用途径。
②在某些情况下单体结构单位被聚合，形成聚合物。
这些特有的生物合成中间体产物需做后几步的结构修饰，修饰的程度取决于产生菌的生理条件。
有些复杂抗生素是由几个来自不同生物合成途径组成的。
第五章发酵培养基
1、培养基通常指人工配制的供微生物生长、繁殖、代谢和合成所需产物的营养物质和原料，同时，培养基也为微生物等提供除营养外的其它生长所必需的环境条件
2、发酵培养基的要求
①培养基能够满足产物最经济地合成
②发酵后所形成的副产物尽可能的少
③培养基的原料应因地制宜，价格低廉；
且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。
④所用培养基应能满足总体工艺的要求，如不应影响通气、提取、纯化及废物处理等。
3、工业上常用的碳源：
葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖
工业上常用的氮源：
无机氮源：
氨水，铵盐，硝酸盐等。
有机氮源：
玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、棉籽粉、鱼粉、酵母浸出液等。
生理酸性物质，如硫酸铵。
生理碱性物质，如硝酸钠。
提供生长因子的农副产品原料：
1）玉米浆
2）麸皮水解液
3）糖蜜
4）酵母：
可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。
产物促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
4、发酵培养基的设计和优化方法
正交试验设计、均匀设计、响应面分析
正交试验设计：
利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。
它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验，通过对这部分试验结果的分析,了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。
正交实验数据分析，见教材P112-114例题，表4-16，同时确定因素的主次顺序、各因素的优水平、各因素水平的最优组合。
小数点后保留一位。
第六章发酵培养基灭菌和空气净化
在发酵工业生产中，为了保证纯种培养，在生产菌种接种培养前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。
1.微生物热阻：
微生物在某一特定条件下（主要是温度和加热方式）下的致死时间。
2.对数残留定律中各符号的意义。
3.理论灭菌时间的计算
3.1间歇实罐灭菌时间的计算
3.2连续灭菌的灭菌时间计算：
4.灭菌温度的选择：
随着温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基中营养成分的分解速率常数的增加倍数。
即当灭菌温度升高时，微生物杀灭速度提高，培养基营养成分破坏的速度减慢。
5.影响培养基灭菌的因素：
所污染杂菌的种类、数量、灭菌温度和时间，培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。
6.无菌空气：
指通过除菌处理使空气中含菌量降低至一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。
此种空气称为“无菌空气”。
7.介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。
是大多数发酵厂广泛采用的方法。
按除菌机制可分为：
绝对（表面）过滤和深层介质过滤。
介质过滤除菌的机理：
空气流通过这种介质过滤层时，借助惯性碰撞、拦截滞流、静电吸附、扩散等作用，将其尘埃和微生物截留在介质层内，达到过滤除菌目的。
第七章种子的扩大培养
1、种子扩大培养：
指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子
2、种子扩大培养的目的与要求
（1）种子扩培的目的①接种量的需要②菌种的驯化③缩短发酵时间、保证生产水平
（2）种子的要求①菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短②生理性状稳定③菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求④无杂菌污染⑤保持稳定的生产能力。
3、种子罐级数：
是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度、所采用发酵罐的容积。
种子罐级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2～4级。
4、种子制备分两个阶段：
实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段
5、种龄：
是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
接种量：
是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
通常接种量：
细菌1-5%，酵母菌5-10%，霉菌7-15%，有时20-25%
青霉素生产的种子制备过程：
安瓿管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵
第八章发酵工艺控制
1、微生物发酵的生产水平取决于生产菌种本身的性能和合适的环境条件。
2、发酵过程的代谢变化
从产物形成来说，代谢变化就是反映发酵中的菌体生长、发酵参数的变化（培养基和培养条件）和产物形成速率这三者之间的关系。
在分批培养过程中根据产物生成是否与菌体生长同步的关系，将微生物产物形成动力学分为①生长关联型和②非生长关联型。
3、发酵方式
（1）补料－分批发酵：
指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。
优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。
低基质浓度的优点：
①可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；
②克服养分的不足，避免发酵过早结束。
（2）半连续发酵：
是指在补料－分批发酵的基础上，间歇地放掉部分发酵液的培养方法。
②克服养分的不足，避免发酵过早结束；
③缓解有害代谢产物的积累。
（3）连续发酵：
指培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液的培养方法。
在这样的环境中培养，菌的生长就受到所提供基质的限制，培养液中的菌体浓度能保持一定的稳定状态。
与传统的分批发酵相比，连续培养有以下优点：
①维持低基质浓度：
可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；
②避免培养基积累有毒代谢物；
③可以提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间；
④便于自动控制。
4、发酵控制参数
按性质分类：
物理参数、化学参数、生物参数
按检测手段分类：
①直接参数：
⑴在线检测参数⑵离线检测参数②间接参数
5、发酵热
发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。
Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射
生物热（biologicalheat）是菌体生长过程中直接释放到体外的热能，使发酵液温度升高。
搅拌热（agitationheat）是搅拌器引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量。
6、发酵过程pH值的一般变化规律
（1）生长阶段：
菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质，生成铵离子，使pH上升至碱性；
随着菌体量增多，铵离子的消耗也增多，另外糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。
（2）生产阶段：
这个阶段pH值趋于稳定。
（3）自溶阶段：
随着养分的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH又上升，此时菌体趋于自溶而代谢活动终止。
7、引起发酵液pH值异常波动的因素
pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件
pH下降：
①培养基中碳、氮比例不当。
碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加上溶氧不足，致使有机酸大量积累而pH下降；
②消泡剂加得过多；
③生理酸性物质的存在，铵被利用，pH下降。
pH上升：
氮源过多，氨基氮释放，使pH上升；
②生理碱性物质存在；
③中间补料氨水或尿素等碱性物质加入过多。
8、临界氧浓度（criticalvalueofdissolvedoxygenconcentration）：
指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。
如对产物形成而言便称为产物合成的临界氧浓度。
呼吸强度又称氧比消耗速率，是指单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以QO2表示，单位为mmolO2／（g干菌体·
h）。
耗氧速率又称摄氧率，是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，以r表示，单位为mmolO2／（L·
9、引起溶氧异常下降，可能有下列几种原因：
①污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在较短时间内下降到零附近，如果杂菌本身耗氧能力不强，溶氧变化就可能不明显；
②菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降；
③某些设备或工艺控制发生故障或变化，也可能引起溶氧下降，如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢，影响供氧能力，使溶氧降低。
10、泡沫的形成及其对发酵的影响
在大多数微生物发酵过程中，通气、搅拌以及代谢气体的逸出，再加上培养基中糖、蛋白质、代谢物等表面活性剂的存在，培养液中就形成了泡沫。
形成的泡沫有两种类型：
一种是发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫；
另一种是发酵液中的泡沫，又称流态泡沫（fluidfoam），分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无明显的界限
大量的泡沫引起的负作用：
发酵罐的装料系数减少、氧传递系统减小；
增加了菌群的非均一性；
造成大量逃液，增加染菌机会；
严重时通气搅拌无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体自溶；
消泡剂的添加将给提取工序带来困难。
泡沫的消除
调整培养基中的成分（如少加或缓加易起泡的原料）或改变某些物理化学参数（如pH值、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次投料）来控制，以减少泡沫形成的机会。
采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素。
采用机械消泡或消泡剂来消除已形成的泡沫。
常用的消泡剂有4大类：
天然油脂类、脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类
11、造成染菌的主要原因设备渗漏空气带菌种子带菌灭菌不彻底技术管理不善
第十章 下游加工过程概论
1、下游技术（工程）（downstreamprocessing）：
对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。
2.发酵液的特点
1）含水多，产物含量低；
2）含菌体蛋白；
3）溶有原来培养基成分；
4）相当多的副产物和色素；
5）易被杂菌污染或使产物进一步分解；
6）易起泡，粘性物质多。
3、整个下游加工过程应遵循下列四个原则
1）时间短；
2）温度低,（选择在生物物质的温度范围内）；
3）pH适中;
4）严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角）。
4、一般下游加工过程可分为4个阶段
1）培养液（发酵液）的预处理和固液分离；
2）初步纯化（提取）；
3）高度纯化（精制）；
4）成品加工。
5、下游加工过程的一般流程
第十二章发酵液的预处理和固液分离方法
1、改善发酵液过滤特性的物理化学方法：
调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。
2、凝聚——指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；
常用的凝聚剂电解质有：
硫酸铝Al2（SO4）3•18H2O（明矾）；
氯化铝AlCl3•6H2O;
三氯化铁FeCl3;
硫酸亚铁FeSO4·
7H2O；
石灰；
ZnSO4；
MgCO3
絮凝——指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。
工业上使用的絮凝剂可分为三类：
1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；
2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；
3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
目前最常见的高分子聚合物絮凝剂有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物
3、杂蛋白的去除方法有沉淀法、变性法、吸附法
4、固液分离的方法：
重力沉降、浮选、旋液分离、介质过滤、离心。
5、根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。
第十三章细胞破碎
1、细胞破碎的阻力：
细菌破碎的主要阻力:
肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；
酵母细胞壁破碎的阻力:
主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；
霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
2、常用破碎方法
机械法：
珠磨法（固体剪切作用）、高压匀浆法（液体剪切作用）、超声破碎法（液体剪切作用）、X-press法（固体剪切作用）。
非机械法：
酶溶法（酶分解作用）、化学渗透法（改变细胞膜的渗透性）、渗透压法（渗透压剧烈改变）、冻结融化法（反复冻结-融化）、干燥法（改变细胞膜渗透性）
3、破碎率的测定方法
1）直接测定法
2）目的产物测定法
3）导电率测定法
第十四章沉淀法（Precipitation）
1、固相析出技术：
通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物溶解度降低，以固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技术。
结晶法：
在固相析出过程中，析出物为晶体称为结晶法。
沉淀法：
在固相析出过程中，析出物为无定形固体称为沉淀法。
常用的沉淀法：
盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。
2、盐析（Saltinducedprecipitation）：
在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。
原因如下：
1）无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；
2）中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；
Ks盐析法：
在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；
β盐析法：
在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；
常用的盐析用盐：
硫酸铵、硫酸钠，磷酸盐，柠檬酸盐。
3、有机溶剂沉淀：
在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。
原理：
（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。
（2）有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。
常用的有机溶剂沉析剂：
乙醇：
沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；
丙酮：
沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；
4、等电点沉淀：
调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。
蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。
第十五章膜过滤法
1、膜过滤法指以压力为推动力，依靠膜的选择性，将液体中的组分进行分离的方法。
基本原理是筛孔分离过程。
在压差的推动下，原料液中的溶剂和小的溶质粒子从高压的料液侧透过膜到低压侧，所得到的液体一般称为滤出液或透过液，而大的粒子组分被膜截留。
包括微滤（MF）、超滤（UF）、纳滤（NF）和反渗透（RO）四种过程。
在工业上用得最广的膜材料是醋酸纤维素和聚砜。
浓差极化：
当溶剂透过膜，而溶质留在膜上，使膜面浓度增大，并高于主体中浓度，这种浓度差导致溶质自膜面反扩散至主体中，这种现象称为浓差极化。
在超滤中，为减少浓差极化，通常采用错流操作。
膜的污染：
膜在使用中，尽管操作条件保持不
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