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protease;
hydrolysis;
peptide;
degreeofhydrolysis;
antioxidant
第一章绪论
1.1鸡蛋清蛋白概况
1.1.1鸡蛋
鸡蛋的构成中，蛋壳（包括壳膜）约占9.5%，蛋白约占63%、蛋黄约占27.5%。
鸡蛋的主要成分为水（75%）、蛋白质（12%）、脂质（12%）以及碳水化合物和矿物质。
鸡蛋三个组成部分的主要化学组成见表1-1[1]。
鸡蛋是人类丰富而平衡的膳食营养来源，它富含蛋白质、脂肪酸、铁、磷、维生B1，B2，B6，B12，D，E，K和微量矿物质[1]。
鸡蛋对人体有重要的营养和防治疾病作用。
鸡蛋中的蛋白质对肝脏组织损伤有修复作用，可促进肝细胞的再生，食用鸡蛋保护肝脏的功能；
鸡蛋中的ω-3脂肪酸被认为能预防心率失常，增强免疫力，增进人类大脑功能和视觉灵敏所必需的一种营养物；
胆碱在促进大脑发育,维持正能和预防癌症方面有重要作用，卵磷脂的吸收可增加血浆和大脑的胆碱含量；
维生素B2起到维持人体正常糖代谢、脂肪代谢的作用分解和氧化人体内的致癌物质，降低脑卒中、急性心肌梗死和猝死等心脑血管病发生率[2]；
鸡蛋中的微量元素，如硒、锌等也都具有防癌作用。
目前研究者已从蛋黄中已经提取了卵磷脂、甘油三酯、脑甘脂、胆固醇和卵黄素等生物活性提高了鸡蛋的利用价值，但蛋清的受重视程度还远远不够，甚至被作为废料弃掉费了宝贵的蛋白质资源，又污染了环境，因此有必要对蛋清进行开发研究。
表1-1鸡蛋的化学组成
部分
蛋白质
脂类
碳水化合
矿物质
蛋壳
3.3
-
95.1
蛋清
10.6
0.03
0.9
0.6
蛋黄
16.6
32.6
1.0
1.1
1.1.2蛋白质种类与含量
蛋清中的蛋白质含量约为9.7%～10.6%，其蛋白质总含量占了鸡蛋蛋白总量的90%以上。
蛋清中含有20多种蛋白质，且绝大多数为糖蛋白，少数为磷糖蛋白。
蛋清中一些主要蛋白质的含量及理化特性等见表1-2。
卵清蛋白是蛋清中主要的蛋白质之一，占蛋清蛋白质的54%，由于它含碳水化合物，归类为磷糖蛋白，是蛋清中唯一含游离巯基的蛋白质，每个卵清蛋白分子含有4个巯基，并有一个双硫基团，是蛋清凝固和胶凝性质的主要因子。
表1-2鸡蛋清中一些主要蛋白质的含量和理化特性[3]
蛋白质名称相对含量（%）PIa相对分子质量T（℃）生物学特性
卵清蛋白544.545,00084.0含磷糖蛋白
卵转铁球蛋白126.176,00061.0结合金属离子
类卵粘蛋白114.128,00079.0抑制胰蛋白酶
卵粘蛋白3.54.5~5.05.5~8.3×
106-Sialoprotein,粘性
溶菌酶3.410.714,30075.0溶解某些种类细菌
球蛋白G24.05.53.0~4.5×
10492.5-
球蛋白G34.04.8---
卵抑制物1.55.149,000-抑制丝氨酸蛋白酶
卵糖蛋白1.03.924,400--
卵黄素蛋白0.84.032,000-结合核黄素
卵巨球蛋白0.54.57.6~9.0×
105-具有强烈抗原性
抗生物素蛋白0.051068,30085.0结合生物素（维生素H）
a等电点；
T水或缓冲液中的变性温度
卵转铁球蛋白占整个蛋清蛋白质的13%，为糖蛋白，不含磷或巯基。
卵转铁球蛋白二价或者三价金属离子紧密地结合，质子磁共振研究表明卵转铁球蛋白上的酪氨组氨酸和精氨酸残基参与了金属、阴离子的结合。
在pH6以上时，每摩尔蛋白分别与两个Fe3+、Al3+、Cu2+、Zn2+形成稳定的复合物。
卵转铁球蛋白与金属离子复合物后对热变性和水解具有耐受性[4]，卵转铁球蛋白在铁传递方面有重要作用，抗菌活性。
蛋清中溶菌酶（E.C.3.2.1.17）的含量在2～4%。
溶菌酶的化学性质稳定，在广泛pH内（1.2～11.3）酶结构不受影响，在pH4～7范围内100℃处理1min仍有近100%的活力，在碱性环境条件下稳定性稍差。
溶菌酶常被作为研究模型来了解蛋白质的结构、动力学和分子折叠性质。
类卵粘蛋白有9个双硫键，三个寡糖单位组成的碳水化合物组分通过天冬酰胺残基与蛋白质连接，因此热稳定性好。
类卵粘蛋白抑制牛胰蛋白酶，它的二级结构组成是26%的α-螺旋，46%的β-折叠和10%的β-转角，呈现高度有序性。
卵抑制物与类卵粘蛋白相似，它抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和微生物来源的一些蛋白酶。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂对硫醇蛋白酶（如无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶）、半胱氨酸蛋白酶（包括组织蛋白酶B、C、H和L，木瓜凝乳蛋白酶，番木瓜蛋白酶Ⅲ）都具有抑制作用。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂与它抑制的蛋白酶形成稳固的复合体，离解常数在10-8~10-12mol/L之间。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂非常稳定，可以在pH12和65℃加热的条件下进行提取。
圆二色性分析显示二级结构中有20%的α-螺旋结构，其他是β-折叠和β-转角结构。
抗生物素蛋白是一种糖蛋白，由4个相同的多肽亚基组成，能与生物素形成稳定的不被肠道吸收的复合体。
抗生物素蛋白的每个亚基结合一个生物素，离解常数为10-15mol/L，抗生物素蛋白与生物素结合的极高的特异性、亲和性是高灵敏性免疫测定和组织化学定位技术的基础。
卵巨球蛋白为糖蛋白，具有强抗原性，是蛋清蛋白质中在免疫学上唯一具有广谱交叉反应的成分。
卵粘蛋白为一种硫化糖蛋白，它是引起蛋清粘性的成分。
卵糖蛋白是一种酸性糖蛋白，卵黄素蛋白能紧密结合核黄素，对它们的功能与生物学性质还了解不多。
1.1.3蛋白质营养价值
蛋白质是动物（人）生存所必须的日粮组分，其在营养中的最基本功能是为机体供充足的必需氨基酸（Essneati!
amni。
acids，EAA），而蛋白质的品质（营养价值）依赖蛋白质分子中所含的氨基酸种类和含量以及消化、吸收后特殊氨基酸的生理利用。
研究究发现，鸡蛋清蛋白含有动物（人）所需的各种EAA，且含硫氨基酸所占比例较，是所有动植物蛋白质中氨基酸最平衡、营养价值最高的一种蛋白源，并常用作评价其它食物蛋白营养价值的参比蛋白。
鸡蛋清蛋白的消化率（人）在98%以上，生物学价值（Biorogiealvarue，By）、蛋白质效率比（Porteinemeseney:
atio，PER）、净蛋白比（Netprotei。
。
atio，NPR）和蛋白质消化率矫正氨基酸分数（Proteindi罗stibili妙correctedmainoacidSeore，PoeAAs）分别为93.7%、3.7、5.1和1.01’711，21，均为所有动植物蛋白之最，其中鸡蛋清蛋白的BV（93.7%）远高于牛乳（54.5%）、鱼（76%）、牛肉（74.3%）和猪肉（74%）。
1.2蛋清的研究现状
如何采用一些合理的方法对鸡蛋进行加工后再利用是目前蛋品研究者和生产者普遍关心的问题。
Stdaelmnna（1999）指出，在合理价格条件下深加工并消费蛋是目前蛋消耗量逐年增加的一个重要原因。
随着加工技术和生产工艺的改进与创新，加工蛋品在总蛋消费中所占比例逐年增加，加工深度与技术含量也不断提高。
到目前为止，主要有3种蛋清深加工方法，即传统的理化加工法、微生物发酵法以及蛋白酶体外酶解法。
1.2.1传统的理化加工法与蛋清产品[5]
采用一些较传统的物理、化学方法或两者相结合加工鸡蛋清，可制得大量的蛋清产品。
主要包括:
①加热干燥生产蛋白片或蛋清粉，用于食品和化工生产;
②通风或鞭打生产含空气的轻质蛋清产品，如蛋白与糖的混合物（meringues）;
③采用一些方法（如乙醇沉淀）生产含低卵类粘蛋白但仍保持蛋清功能特性（如鞭打性（whippbaliiyt）、起泡性等）的蛋清产品，用作卵类粘蛋白过敏人群的食品；
④与其它一些物质反应生产食用胶，用于医药与食品生产；
⑤直接从蛋清中提取一些生物活性蛋白如卵白蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白等并用于营养、生物化学、分子生物学、医药和食等研究。
1.2.2微生物发酵与蛋清产品
选用一些适宜的微生物对鸡蛋清进行发酵，不仅可生产蛋清饮料，还可生产具有免疫调节作用的活化卵白蛋白。
蒲万霞等人研究发现，小鼠口服经酵母发酵鸡蛋清制得的活化卵白蛋可促进其生长，提高小鼠抗感染能力和小鼠巨噬细胞的吞噬功能，显著缓解（冷、热）应激所致的小鼠淋巴器官（胸腺和脾脏）萎缩回，提高嗜中性粒细胞的吞噬和杀菌活性，增强红细胞免疫功能，以及促进脾淋巴细胞增殖。
1.2.3蛋清的冷杀菌技术
在收购、运输、储藏鸡蛋和分离蛋清的操作过程中，容易使液体蛋清污染沙门氏菌、大肠杆菌等有害细菌，引起食源性疾病的发生。
因此必须在连续监控下生产液体蛋清，并在上市前杀菌。
目前最常用的杀菌方法是巴氏杀菌，即加热一定时间使细菌失活。
但是即使轻微的热处理也会引起蛋清起泡、乳化、胶凝功能性质的损失和改变，进而降低产品的质量。
冷杀菌技术是一种新技术,既能杀灭食品中微生物，又能最大限度保持食品色泽、香味、营养成分及功能性质。
冷杀菌技术包括超高压杀菌、高压脉冲电场杀菌、脉冲强光杀菌、臭氧杀菌、膜分离杀菌、紫外线杀菌等。
1.2.4蛋清酶水解物
蛋清蛋白经过蛋白酶水解后，分子量降低，原来蛋白质的功能性质得到改善，蛋白质的致敏性降低，更易于消化，并且水解物还具有抗高血压、抗胆固醇等生物活性，这些优点使得蛋清水解物研究得到人们的重视。
金嫘[5]、宿哲然[6]、孟祥晨[7]研究了蛋清酶解的工艺条件，张英君研究了酶解产物的功能性质[8]，刘静波等研究了高F值寡肽酶解产物的制备方法[9]。
Lee等用木瓜蛋白酶水解蛋清，得到的蛋清水解物的起泡能力和蛋糕体积指数都得到提高[10]。
1.3本课题的研究目的及意义
目前我国的禽蛋加工状况是蛋品加工水平低、技术陈旧，有些产品不进行加工而直接上市销售，在一定程度上降低了产品的销售等级，产品的附加值低。
鸡蛋清经适宜的蛋白酶酶解后，不仅可在一定程度上改善其功能特性（如溶解性、鞭打性、稳定性等），还可降低过敏原性蛋白的抗原性,进一步提高鸡蛋清的食用品质和营养价值.
过去数十年的大量研究表明，鸡蛋中的蛋白质和多肽在满足基本的营养需求以外还发挥着多种不同的生物学功能。
现已认为鸡蛋的蛋白质具有一些生物学活性，包括新颖的抗菌活性、免疫调节活性、抗癌活性以及抗高血压活性。
这些都体现出鸡蛋的蛋白质在人类健康以及疾病的预防和治疗中的重要作用。
继续研究鸡蛋中蛋白质及其衍生的、新的以及已经判明的生物学功能，有助于开发出新的方法从而进一步提高鸡蛋的利用价值，使其成为有益人类和动物健康的、具有广泛生物活性物的来源，并探索其在治疗及预防慢性传染病中的重要作用。
将蛋清进行酶解获得具有生物活性的寡肽,具有十分重要的价值。
本实验以鸡蛋蛋清为原料，研究了酶解鸡蛋清的适宜条件以制备蛋清抗氧化活性肽。
1.4本课题的主要研究内容
本文的主要研究内容有：
1.测定各种酶的活力。
用国际标准酶活力测定法测定了中性蛋白酶、碱性蛋白酶等七种酶的活力。
2.筛选适合水解蛋清蛋白的蛋白酶。
通过探讨影响蛋清蛋白水解物多肽得率、水解度、抗氧化性的因素，筛选出酶解蛋清蛋白的适宜蛋白酶。
3.确定蛋清蛋白水解物的制备工艺条件。
设计单因素实验和正交实验，研究水解物多肽得率、水解度、抗氧化性，确定酶解鸡蛋清的最佳工艺条件。
第二章实验材料与方法
2.1主要实验材料
2.1.1实验材料与试剂
新鲜鸡蛋购自齐齐哈尔市大润发超市
碱性蛋白酶（novozymes）丹麦诺唯信公司
中性蛋白酶（novozymes）丹麦诺唯信公司
风味蛋白酶（novozymes）丹麦诺唯信公司
复合蛋白酶（novozymes）丹麦诺唯信公司
复合蛋白酶（动物酶）南宁庞博生物技术有限公司
复合蛋白酶（FH-N-GA）南宁庞博生物技术有限公司
碱性蛋白酶（十万单位）南宁庞博生物技术有限公司
分析纯三氯乙酸天津市凯通化学试剂有限公司
分析纯酒石酸钾纳天津市化学试剂一厂
分析纯无水硫酸铜天津市凯通化学试剂有限公司
分析纯无水碳酸钠天津市科密欧化学试剂有限公司
分析纯氢氧化纳天津市科密欧化学试剂开发中心
分析纯无水乙醇天津市凯通化学试剂有限公司
茚三酮国药集团化学试剂有限公司
分析纯浓盐酸黑龙江省双城市鑫田化学试剂制造有限公司
三羟甲基氨基甲烷北京化学试剂公司
磷酸氢二钠西安化学试剂厂
磷酸二氢钠北京双环化学试剂厂
EDTA哈尔滨市金丽化工试剂有限公司
2.1.2实验仪器与设备
UV757CRT紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司
722可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司
电热恒温水浴锅上海跃进医疗器械厂
指针式电热恒温水浴锅上海跃进医疗器械厂
电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司
TDL-5-A型低速台式离心机上海安亭科学仪器厂
电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂
DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器江苏省金坛市医疗仪器厂
水浴恒温震荡器上海跃进医疗器械厂
超声脱气仪上海科导超声仪器有限公司
分析天平北京赛多利斯仪器系统有限公司
TU-1901双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司
LG10-2.4A型高速台式离心机北京医用离心机厂
海尔冰箱中国青岛海尔有限公司
2.1.3主要试剂的配制
1.磷酸缓冲溶液（pH7.5）
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）3.01g，磷酸二氢钠（NaH2PO4•2H2O）0.25g混合，加水溶解并定容至500ml。
2.三氯乙酸0.4mol/L
称取三氯乙酸65.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
3.碳酸钠溶液0.4mol/L
称取无水碳酸钠粉末42.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
4.氢氧化钠溶液0.5mol/L
称取固体氢氧化钠2g，用蒸馏水溶解并定容至100ml。
5.酪素溶液
称取酪素2.000g，精确至0.002g，用少量0.1mol/L10mlNaOH溶液润湿后（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴），在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，加入适量的pH7.2缓冲液定容至100ml，此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。
6.L-酪氨酸标准溶液100μg/ml
a.称取于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60ml溶解后定容至100ml，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。
b.吸取1mg/ml的酪氨酸标准溶液10.00ml，用0.1mol/L盐酸定容至100ml，即得到100μg/mlL-酪氨酸标准溶液。
7.福林试剂的制备
于2000ml磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4•2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）25g、水700ml、85%磷酸50ml、浓盐酸100ml，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50ml和数滴浓溴水（99%）,在微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸出去过量的溴），冷却，加水定容至1000ml。
混匀，过滤。
制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液:
一份福林试剂与一份水混合，摇匀。
8.福林-酚甲液
a．称取1.000g无水碳酸钠粉末，溶于50ml0.1mol/LNaOH溶液配制成B液。
此溶液需现用现配。
b．称取1.000g硫酸铜，用蒸馏水定容至100ml，即得到1%的硫酸铜溶液。
c．称取2.000g酒石酸钾纳，用蒸馏水定容至100ml，即得到2%的酒石酸钾纳溶液。
等体积混合1%的硫酸铜溶液和2%的酒石酸钾纳溶液，移取1ml于B液中，即得到福林-酚甲液。
9.茚三酮显色剂
称取茚三酮0.5g，果糖0.3g、Na2HPO4·
10H2O10g及KH2PO46g，用蒸馏水定容至100ml。
10.乙醇溶液
量取40ml无水乙醇，加入60ml蒸馏水混合，即得到40%乙醇溶液。
11.盐酸溶液
（在通风橱中操作）量取4.5ml原装弄Hcl，倒入装有半瓶水的500ml试剂瓶中，加蒸馏水稀释定容至500ml，充分摇匀。
12.Tris-Hcl缓冲液（PH=8.2）
量取50ml0.1mol/l三甲基氨甲烷溶液，加入22.9ml0.1mol/l盐酸，用蒸馏水定容至100ml。
13.三甲基氨甲烷溶液
称取0.6057g三甲基氨甲烷溶液，用蒸馏水定容至50ml。
14.邻苯三酚溶液
称取0.0378g焦性没食子，用10mmol/lHCL定容至100ml。
15.亚油酸储备液
量取15ul亚油酸溶于50ml0.2mol/l磷酸盐缓冲液中，10000r/min均质10min，使溶液呈乳白色，0℃保存，24小时内使用。
16.FeCl2-EDTA溶液
称取lFecl29.95g，EDTA18.6g用蒸馏水定容至1000ml。
17.乙醇（含0.3mol/LHCL）溶液
量取75ml无水乙醇，加入0.3mol/LHcl25ml，即得到75%乙醇溶液（含0.3mol/LHCL）。
18.FeCl2溶液
称取lFecl29.95g用蒸馏水定容至500ml。
19.硫氰酸钾溶液
称取40g硫氰酸钾,用蒸馏水定容至100ml，即得到40%硫氰酸钾溶液。
2.2检测方法
2.2.1蛋白酶活力测定法—福林法[11]
（1）原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如：
酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计测定，计算酶活力。
（2）测定步骤
①标准曲线的绘制
按表2-1配制不同浓度的酪氨酸溶液
表2-1a.L-酪氨酸标准溶液
管号
酪氨酸标准溶液的浓度/μg/ml
取100μg/ml酪氨酸标准溶液的体积/ml
取水的体积/ml
０
10
１
2
8
２
20
4
6
３
30
４
40
５
50
b.分别取上述溶液各1.00ml（须做平行样，2～3个），各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml，福林试剂使用液1.00ml，置于40±
0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长660nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。
②测定各种酶活力
取15×
100mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入样品稀释液1ml，置于40℃水浴中预热2min，再加入经同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10min后加入2.0mL的4%三氯乙酸溶液终止反应，在40℃水浴锅中静置20min后过滤。
取1.0mL滤过液，依次加入5.0mL的0.4mol/LNa2CO3溶液，1.0mL已稀释的福林试剂，混合后于40℃水浴中静置20min。
在660nm波长下以空白管做参比测定吸光度。
空白管在加入酪蛋白溶液和蛋清溶液后，先加入三氯乙酸溶液再加入酶溶液。
实验重复3次，数据取平均值。
酶活的计算如下：
在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为1个酶活力单位。
样品蛋白酶活力单位（干基）=样品蛋白酶活力单位=
式中，A——由样品测得的OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或OD值×
K）；
4——4ml反应液取出1ml测定（即4倍）；
N——酶液稀释的倍数；
10——反应10min；
W——样品水分含量；
K—吸光常数；
2.2.2蛋白质含量测定法—福林-酚法[12]
用福林-酚法测定试
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