细胞工程期末考试复习Word文档下载推荐.docx
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位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。
c无菌操作室:
专用于无菌操作
5.培养与观察室
本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。
孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行，后者费用高，一般实验室多采用孵箱进行工作。
植物细胞工程实验室的设置：
清洗室、制备室、灭菌室、接种室、培养室、鉴定室、驯化移栽室。
第二章
1、玻璃用品的清洗
在细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清洗。
清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质。
某些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。
因此，玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行。
一般玻璃器皿的清洗包括：
浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤
①浸泡
初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。
培养后的玻璃器皿多附有大量蛋白质，用完后应立即初步刷洗，浸泡在蒸馏水中，注意让水完全进入瓶皿中，不要留有气泡。
使用新的器皿应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸（5％）浸泡过夜或煮沸30分钟，中和其中的碱性物质后再清洗。
②刷洗
浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加热）刷洗。
③浸酸
刷洗不掉的极微量杂质经过清洗液浸泡的强氧化作用可被除掉。
清洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污十分有效，是清洗过程中关键环节。
④冲洗
玻璃器皿浸酸后必须用流水充分冲洗，每个器皿用流水灌满、倒掉，必须重复10次以上，不留任何残迹。
最后用蒸馏水漂洗3-5次，烤干备用。
化学消毒方法指使用化学药物杀灭、清除环境中的致病性微生物及其他有害微生物，或者抑制其生长、繁殖。
物理消毒法是指利用物理因素杀灭或消除病原微生物及其他有害微生物的方法
滤过除菌
此法适用于消毒大多数细胞培养用液，如培养液、消化液、Hanks液、血清以及其他不能用高压蒸汽消毒的液体。
用孔径0.22微米微孔滤膜可除去细菌和霉菌等
紫外线
适用于无菌室、超净工作台的消毒。
紫外线的波长为200-300nm，最强是在254nm，6-15平方米最少一只紫外灯，高度要在2.5m以下，湿度45%~60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，实验前应不低于30分钟的照射时间。
优点：
消毒效果好，面种大，使用方便。
缺点：
产生臭氧、气味难闻。
煮沸消毒
金属器械和胶塞在水中煮20~30分钟，趁热倾去水分即可使用。
紧急情况时使用。
化学消毒
化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学药物进行消毒灭菌的方法。
实验室地面、桌面、用具及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒杀菌。
几种常用消毒剂的效果比较
消毒剂使用浓度（％）消毒时间（分）效果残液去除难易
次氯酸钙105～30好易
次氯酸钠2～55～30好易
新洁尔灭10～205～30好易
氯化汞0.1～12～10最好最难
过氧化氢10～125～15较好最易
抗菌素4～50mg/L30～60较好较难
第三章
原代（初代）培养期：
从机体取下组织培养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。
维持时间，因细胞种类不同，一般1-4周。
传代期培养：
初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长
活体染色
体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即活体染料）对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。
利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，染色后的培养物还可以继续进行培养。
污染途径
A.空气
措施：
减少空气流动
B.器材
消毒彻底，洗刷干净，定期消毒
C.操作
严格进行无菌操作，避免交叉感染
D.血清
E.组织样本
很难避免
第四章
体外细胞培养物的生长类型
1）贴壁型细胞:
附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
特点：
唯有粘附于固相表面才能生存的细胞
2）悬浮型细胞:
不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。
特点:
在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团
培养细胞的生长特点
1、贴附
细胞接种后，很快在与底物邻接处形成伪足式接触点。
贴附并伸展式贴壁细胞体外培养时的基本生长特点。
2、接触抑制
当培养细胞分裂增殖相互间密切接触时，细胞停止活动的现象为接触抑制。
（非正常细胞如癌细胞除外）。
3、密度抑制
细胞密度过大，代谢物增多，营养物质耗尽导致分裂停止
4.繁殖代数有限
与端粒结构有关
5.核型（染色体）正常
表明没有明显的基因改变
6.呈现去分化状态
从机体内取出的细胞具有不同分化状态，培养时表现去分化，以至分不出细胞最初的来源。
7.细胞无恶性
表现在将该细胞注入免疫抑制动物不能形成肿瘤；
原代培养（primaryculture）：
即细胞或组织离开机体后的首次培养。
传代（passage）：
培养的细胞生长到一定的密度后转移到新的容器中培养或需要更换到新的培养液称为传代或传代培养。
细胞系（cellline）：
原代培养物经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
如果不能继续传代或传代数有限，可称为有限细胞系。
如果可以连续传代则称为连续细胞系。
原代培养细胞成功传代即为细胞系。
细胞株（cellstrain）：
从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。
克隆（clone）：
亦称无性系。
指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。
第五章
动物细胞融合的常用方法
1、自发融合过程
2、人工诱发融合
1}病毒诱导细胞融合
2）、化学法—PEG结合高pH、高Ca＋诱导法
3）物理法—电融合诱导法
单克隆抗体
由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。
第六章
体外受精
体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。
超数排卵：
是指人为注射外源促性腺激素，促使卵巢排出较正常情况下更多的成熟卵子
体外受精技术程序
1、卵母细胞的采集和成熟培养
（1）卵母细胞的采集
（2）卵母细胞的选择
（3）卵母细胞的成熟培养
2、精子的获能处理
3、体外受精方法
1.}常规体外受精技术
2}.与分离精子相结合的体外受精技术
3.}显微受精技术
4、受精卵的体外培养
5、胚胎移植
胚胎移植的概念
胚胎移植（embryotransfer）也称受精卵移植，是指一头母畜（称为“供体”）发情排卵并经过配种后，在一定时间内从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或胚胎，然后把它们移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的输卵管或子宫角。
这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。
胚胎移植的技术程序
1.供体、受体的选择；
2.超数排卵；
3同步发情；
4.人工受精；
5.胚胎采集；
6.胚胎的检查与鉴定；
7.胚胎移植。
核移植技术
所谓核移植技术就是利用显微操作技术将外源细胞核移入去核卵母细胞中，再移植入代孕母体内，使其发育为含有与供体细胞相同遗传物质的个体。
从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。
核移植技术的一般操作程序
核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步骤。
第十一章
第十二章
植物快速无性繁殖的概念
将来自优良植株的茎尖、腋芽、鳞片、叶片等器官、组织或细胞进行离体培养，以期在短期内以快速获得遗传上稳定一致的大量个体。
病毒在植物体内的分布
在植物体内的分布具有不均匀性，随植株不同部位和年龄而异。
在受侵染的植株中，顶端分生组织一般说或者是无毒的，或者是只携有浓度很低的病毒。
在较老的组织中，病毒数量随着与茎尖距离的加大而增加。
（一）植物脱毒原理：
1）植物病毒本身不具有主动转移的能力。
2）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒的复制。
3）在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。
4）在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖。
茎尖脱毒方法
①取样与消毒
可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。
采顶芽与侧芽消毒接种。
消毒方法是：
剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸钠或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用无菌水冲洗材料4-5次
②茎尖剥离和接种
将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上----器械固定----解剖镜下剥去幼叶----切下带1-2个叶原基的生长点（0.3-0.5mm）----切下的茎尖转至培养基上（顶部向上）。
③培养
25+2℃，1500-5000LX，10-16h
一般光照培养比暗培养效果好。
其间应更换新鲜培养基。
提高培养基中BA的浓度可形成大量从生芽。
④生根诱导
诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生根培养基继续培养1-2个月可生根。
在茎尖中影响脱毒效果的因素
A培养基
MS培养基是常用的较好的适于茎尖培养的培养基之一。
一般来说，含有少量（0.1－0.5mg/L的生长素或细胞分裂素或二者皆有常常是有利的。
避免使用2，4－D，因为它通常能诱导外植体形成愈伤组织，广泛使用的生长素是NAA和IAA，其中NAA由于比较稳定，效果更好。
B外植体大小
优缺点：
茎尖越小，去病毒机会越大，脱毒效果就越好，但同时因为其含营养及水量太低，故培养时对培养基的要求就越高，对剥离技术要求也越高。
C培养条件
在茎尖培养中照光培养通常都比暗培养的效果好。
在马铃薯中建立茎尖培养物的最适光照强度是100lx，但4周后应增加到200lx。
当茎已长到1cm高时，光照强度应进一步增加到4000lx。
温度通常是25℃+2℃
D外植体的生理状态
茎尖最好是由活跃生长的芽上切取。
在麝香石竹和菊花中，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。
但在草莓中Boxus（1977）没有看到这种差别。
即使在腋芽比顶芽表现较差的情况下，为了增加脱毒植株的总数也还是要采用腋芽，这是因为腋芽在每个枝条上有好几个，而顶芽只有一个
取芽的时间也是个重要因素，这对于温带树种，植株的生长只限于短暂的春季，此后很长时间茎尖进行休眠，直到低温或光打破休眠为止。
在这种情况下，茎尖培养应在春季进行，而若要在休眠期进行，则必须采用适当处理。
在李属植物中，取芽之前必须把芽保存在4℃下近6个月之久。
茎尖培养的效率除取决于外植体的存活率和茎的发育程度之外，还取决于茎的生根能力及其脱毒程度。
在麝香石竹中，虽然冬季培养的茎尖产生的茎最易生根，但夏季得到无病毒植株的频率最高。
在所研究过的大多数马铃薯品种中，在春季和初夏采集的茎尖比在较晚季节采集的容易生根。
第十三章
花粉培养成苗途径与花药培养比较:
相同点：
胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径
不同点：
花粉培养：
花粉分离收集及培养方式（需进行花粉的分离,特殊的花粉诱导培养）
花粉培养优点（与花药培养比）：
a、花药培养容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生植株会出现不同倍性的个体，而分离的花粉培养可以克服这一不足。
b、能更好调节控制核发育的各种因子，而且可以直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程，为研究雄核的生理生化等问题提供方便。
c、原则上将，从花粉培养能得到更多的花粉植株。
d\花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。
花药培养不需要进行游离花粉的处理，也不需要特殊的培养方法，因而比花粉培养方便快捷;
花粉培养（pollenculture）的精确定义是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养技术,属于细胞培养。
十六章
原生质体培养的概念：
去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
体细胞杂交的概念
又称为原生质体融合，是指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种细胞，并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术
原生质体的分离方法
机械分离法
－先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球形式，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可以释放出完整的原生质体。
－优点：
该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。
－缺点：
获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制
常用的细胞壁降解酶种类：
纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等。
优点：
可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。
影响所获原生质体的活力。
原生质体的培养方法
1）液体浅层培养
2）液体-固体双层培养法
3）固体平板培养
原生质体的培养程序
细胞壁再生：
体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。
细胞分裂形成细胞团：
一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。
器官形成植株再生：
从愈伤组织诱导发生
胚状体发育
植物体细胞杂交的概念和意义
又称为原生质体融合，是指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种细胞，并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。
即离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。
植物体细胞杂交的程序
1.原理
细胞膜的流动性
植物细胞的全能型
2.
植物原生质体融合的方法
2.常见的植物组织培养污染的原因有哪些？
如何控制？
答案要点：
（1）材料带菌；
控制方法：
为彻底灭菌，初始接种时使用适当大小的外植体，每次继代之前对继代的材料仔细检查（1.5分）。
（2）接种污染；
控制方法及时检查修理超净工作台，操作细心，接种工具及时消毒，工作态度积极，规范操作（1.5分）。
（3）培养过程中感染；
控制方法定期对培养空间进行消毒处理，及时清除污染材料，转移继代材料（1.5分）。
（4）培养基的污染：
控制方法是在培养基中加入抑菌剂（1.5分）。
3.茎尖培养为什么能够脱除植物病毒？
原理即“植物体内病毒梯度分布学说”（1分）：
病毒在植物体内的分布是不均匀的，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近顶端分生区域的病毒感染浓度越低，生长点（越0.7-1.0mm）则几乎不含或含病毒很少（2分）（由于病毒运转速度慢，加上茎尖分生组织没有维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以生长点的病毒数量极少或无）（2分）。
因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒（1分）。
4、在利用植物茎尖脱毒培养操作技术中，有哪些细节问题要特别注意？
寻求适合的培养基（2分）；
必须使用解剖镜剥离茎尖，速度要快，防止茎尖变干（2分）；
注意外植体的大小与成活率、脱毒效果、再生
茎尖脱毒培养的原理是什么？
在剥离茎尖时，应注意什么细节问题？
茎尖培养脱毒的原理即“植物体内病毒梯度分布学说”：
病毒在植物体内的分布是不均匀的，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近顶端分生区域的病毒感染浓度越低，生长点（越0.7-1.0mm）则几乎不含或含病毒很少（由于病毒运转速度慢，加上茎尖分生组织没有维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以生长点的病毒数量极少或无）。
因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。
（5分）
应注意问题：
由于茎尖越小其带毒率越低，脱毒效果越好，但是操作难度越大，培养成活率及形成完整植株的能力越弱；
茎尖越大，其操作越容易，茎尖培养成活率及形成完整植株的能力越强，但茎尖的带毒率越高，其脱毒效果就越小，所以在剥离茎尖时，要兼顾脱毒率、成活率及茎尖发育成完整植株的能力。
（5分）
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