酶工程课程复习资料整理Word格式.docx
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如乳糖合酶
修饰亚基的水平是由激素控制的。
妊娠时，修饰亚基在乳腺生成。
分娩时，由于激素水平急剧的变化，修饰亚基大量合成，它和催化亚基结合，大量合成乳糖。
3.共价修饰调节：
如糖原磷酸化酶、磷酸化酶b激酶
4．限制性蛋白水解作用与酶活性控制。
如酶原激活
5．抑制剂和激活剂的调节
6．反馈调节
7．金属离子和其它小分子化合物的调节
8．蛋白质剪接
五．反馈调节（概）：
催化某物质生成的第一步反应的酶的活性，往往被其终端产物所抑制。
这种对自我合成的抑制叫反馈抑制。
A-J：
代谢物
实线箭头：
酶促催化步骤
虚线箭头：
反馈抑制步骤
代谢途径的第一步和共同底物进入分支途径的分支点是反馈抑制的最为重要的位点。
六．蛋白质剪接（概）：
一个单一的前体蛋白通过剪接机制可以产生多种蛋白质（酶）分子，从而具有不同的功能或活性。
蛋白质剪接中，被切去的肽段称为内含肽（intein），连接起来形成成熟蛋白质的肽段称为外显肽（extein）。
蛋白质剪接的机制目前仍然是不清楚的。
第二节酶的组成、分类和命名
一．酶的化学组成
掌握酶蛋白和辅因子在酶促反应中的作用，一个决定了酶和底物结合的性质，即酶的专一性，还有决定了酶催化反应的类型。
二．国际系统分类法及编号
1．六大蛋白类酶
①氧化还原类酶AH2+B→A+BH2
②转移酶AB+C→A+BC
③水解酶AB＋H2O→AOH+BH
④裂合酶AB→A+B
⑤异构酶
⑥连接酶或合成酶
A+B+ATP→AB＋ADP+Pi（或AB＋AMP+PPi）——在ATP供能下，将A和B结合在一起
2．两个比较容易混淆的酶
1）氧化磷酸化与光合磷酸化中，以跨膜质子动力势为动力推动ATP形成的酶是ATP合成酶还是ATP合酶？
催化的反应：
ADP+Pi→ATP裂合酶的逆向反应
合成酶：
synthetase;
合酶：
synthase
答：
应该叫做合酶
2）DNA（RNA）聚合酶属于六大类酶中的什么类型？
催化的反应：
dATP+DNADNA-dAMP+PPi
dATP=dAMP+PPi
通式：
AB+C→AC+B所以属于转移酶
要记住各大类酶的编号，作用特点，会判断反应类型
第三节酶的活力测定
一．酶活力（概）：
在一定条件下，酶所催化的化学反应速度，它可以用单位时间内底物的减少量或产物的增加量表示。
二．酶活力测定方法的注意事项：
1．底物及底物浓度的选择
a.根据其专一性选择底物；
b.一般采用高底物浓度测定法（10-20Km），
因为高底物浓度时反应速度无限接近于最大速度，10-20Km，接近又不浪费
注意：
不是所有酶测定酶活是都采用高底物浓度测定法，有底物抑制作用的酶（即在高底物浓度条件下活性降低的酶不能用这种方法）
三．比活力（概）：
在特定条件下，每毫克（mg）酶蛋白所具有的酶活力单位数，即：
酶比活力=酶活力（单位）/mg蛋白。
它是酶纯度的一个指标。
四．酶的转换数（概）：
又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。
即每摩尔（或微摩尔）酶每分钟催化底物转变为产物的摩尔（或微摩尔）数，是酶催化效率的一个指标。
通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示，单位为min-1。
五.酶的催化周期（概）：
是指酶进行一次催化所需的时间，单位为毫秒或微秒。
在数值上等于酶的转换数的倒数。
第四节酶的结构与功能
一．酶分子中的氨基酸残基对酶促反应的不同贡献
四种残基，列出作用后要能判断是哪一种类型
二．酶的活性部位（中心）
掌握概念和结构组成的两部分
1．概念：
酶分子中，显示酶的催化活性的特殊部位称为活性部位。
2．结构组成：
*底物结合部位与催化部位并不是绝对的，活性中心的某些基团同时兼有这两种功能。
三．酶活性基团的鉴定：
掌握两种物理方法的特点
掌握酶分子三种失活所对应的集团
四．酶的结构改变对其催化功能的影响
掌握：
破坏了哪一种集团以后会引起怎样的结果
（一）酶的一级结构改变对其催化功能的影响
1．主链断裂
①切除非贡献残基—几乎不影响酶活（但不能过长）
②切除接触残基、辅助残基和结构残基—酶活性丧失
③酶原激活—显示出催化活性；
实质：
活性中心的形成和暴露。
2．二硫键断裂
影响空间构象—酶活性丧失
不影响空间构象—不影响酶活性
（二）酶的二、三级结构改变对其催化功能的影响——酶活丧失
（三）酶的四级结构破坏对其催化功能的影响
第五节酶的作用机制
一．酶和底物结合的作用力
它们都是非共价结合
离子键：
底物上的一个带电荷的基团与酶分子的另一种带相反电荷基团的作用。
本质：
静电吸引力。
氢键：
底物与酶蛋白的两个电负性较大的原子，如N,O共同享有氢原子而形成的结合力。
范德华力：
底物与酶蛋白的两个原子在相距0.3-0.4nm时存在的一种非专一性的吸引力，弱，专一性小。
当酶与底物处于立体互补时，大量的范德华键的形成就导致了酶的专一性的出现。
二．酶催化反应降低活化能的来源
1．酶分子中的催化功能基团（特定的氨基酸残基侧链、金属离子和辅酶）与底物形成瞬时的共价键，并激活底物参与化学反应，甚至有时底物分子上的某些基团还可以暂时性的转移到酶分子的功能基上。
这些可以提供另外的低能途径来降低反应的活化能。
（次要）
2．酶促反应降低的活化能主要来源于酶与底物间的非共价相互作用（结合能）。
ES复合物中每一个弱的相互作用的形成，都伴随有少量的能量释放。
由于这部分结合能的释放，部分的抵消了非酶反应时所需要吸收的能量，因此反应的活化能水平大大降低。
而这种弱的相互作用在酶催化反应的过渡态时更为有效。
三．一个所谓进化完全的酶必须具备与基态底物弱结合而与过渡态底物强结合的性质。
四．能障
（大概理解一下，这个不准确）S与P之间还存在有能障（energybarrier），这个能障用于反应过程中基团的重新排列、不稳定的瞬时电荷的形成、化学键的重排，以及其它反应所要求的转变步骤等
2．能障的意义：
如果没有能障，细胞内复杂的大分子将会自发地回复到其较为简单的分子形式，细胞所具有的高度复杂有序的结构以及代谢过程都将不复存在。
酶分子正是通过长期进化而来的用于选择性降低细胞生存所必须反应的活化能的。
五．趋近与定向效应（概）：
由于酶分子具有活性中心，活性中心上的基团可以与底物相互接近，并使底物集团与酶活性中心的催化集团按照正确的方位几何定向，有利于种间产物的形成和催化反应的进行。
六．构象变化效应（概）：
当酶分子与底物分子互相接近时，由于两者的相互作用，酶分子和底物分子都会发生构象变化，从而更有利于酶与底物的结合和反应，使反应速度大大提高。
七．多元催化（概）：
由于酶和底物的结合，在酶促催化过程中通常可以几个基元反应配合在一起共同作用，从而使酶反应加速。
八．酸碱催化
酶和底物分子之间通过质子（H+）传递作用，即酸和碱的相互转变，从而有利于过渡态的形成和稳定，使得反应所需的活化能降低，使反应加速进行
2．影响因素：
a.酸碱强度
b.供出或接受质子的速度
为什么组氨酸含量少，但却很重要，主要从上面两个角度进行探讨，它在这两个方面有什么优势
九．共价催化
①概念：
在酶的催化作用中，底物和酶形成一个反应活性很高的共价中间产物，这可以通过提供另外的低能途径而降低反应所需的活化能，使反应加速进行。
②分类
以下两种催化，到底是酶上还是底物上有亲电集团
酶底物
亲核催化亲核基团（富电子）攻亲电基团（缺电子）
亲电催化亲电基团（缺电子）击亲核基团（富电子）
十．微环境效应（概）：
酶的活性中心上的催化基团处于一种特殊的疏水反应环境，使得酶的催化基团被低介电环境所包围，并可以排除高极性的水分子。
这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，从而加速酶反应。
这种作用称为微环境效应。
十一.酶活性部位的柔性（我国科学家邹承鲁先生首次提出）
天然状态的酶具有完整的三维空间结构，其中活性部位跟其它结构部位相比，具有较大的柔性，也就是说酶活性部位基团的运动性较大。
因此，当低浓度的变性剂作用时，酶分子整体刚性部分构象保持完整，而较柔性的活性部位的局部结构已发生明显变化，如活性基团的相互靠近和立体取向受到破坏，导致酶活性的丧失。
2．意义：
酶活性部位的柔性是酶充分表现其活性所必需的
①满足底物结合诱导的构象调整（诱导契合），使得活性部位的活性基团形成一定的空间取向，以保持一个适应催化反应的空间微环境；
②残基侧链活性基团的运动更加有利于催化的高效性；
③很多酶的催化效率和底物专一性受到其它因素的调节，这就要求酶的活性部位保持一定的柔性，使其局部环境受到调节因素的影响后能发生细微的构象变化，从而调节酶的活性和底物专一性。
3．柔性与刚性之间的辩证关系
酶的柔性和刚性是局部的，也是相对的
①对于局部柔性部位的维持必须要有刚性部分来支撑；
②酶分子既要保持相对稳定的整体结构，又必须要有相对柔性的微环境状态。
正是这种刚柔相济的独特酶分子结构，构成了酶的催化作用高效性和可调节性的结构基础。
十二.辅因子在酶促反应中的作用之金属离子
不会出问答题，但5个作用一定要理解
①使酶稳定于催化活性构象；
②金属离子本身可得到电子或失去电子而发生价态的变化，因而可以作为亲核剂或亲电剂；
③金属离子还可以通过接受或供出电子，激活亲电剂或亲核剂；
④金属离子带正电荷，因此可以掩蔽亲核剂，以防止不需要的副反应发生；
⑤通过配位键，将酶和底物结合在一起，使底物趋近酶分子，并促使酶的活性中心与底物之间的反应基团具有正确的空间定向。
第六节酶催化反应动力学
一．根据中间产物学说推导米氏方程
根据中间产物学说，单底物单产物酶促反应可以表示为：
由于E+S→ES的速度极小，尤其是在反应处于初始阶段时，故k-2可忽略不计。
因而酶催化反应方程可以简化为；
根据稳态学说，有：
即：
由于[E0]=[E]+[ES]，因此上式可以表示为：
则：
Km[ES]=[E0][S]-[ES][S]
因此
由于v0=k2[ES]，vmax＝k2[E0]，所以
一般反应体系中，底物浓度远大于酶的浓度，故酶－底物络合物ES的形成对底物浓度而言可以忽略不计，故可以用[S0]代替[S]，于是上式可以写为：
二．米氏方程的讨论
1．Km的意义：
达到1/2最大反应速率时的底物浓度
2．Km是酶的特征常数，它可以表示酶同底物的亲和力
Km大，亲和力小；
Km小，亲和力大
3．Km是酶的特征常数，它是针对特定的反应与特定的反应条件而言的。
不同的酶，具不同的Km值；
同一种酶作用于不同的底物，具有不同的Km值；
同一种酶，催化同一种底物反应，但反应条件不同，也具有不同的Km值。
一般而言，Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。
4．判断酶的最适底物：
Km最小，也叫天然底物
5．计算一定速度下的底物浓度或一定底物浓度下的反应速度。
（即记熟米氏方程）
6．了解酶的底物浓度在体内具有的浓度水平：
（即在Km值附近）
一般说来，作为酶的最适底物，其在体内的浓度水平应接近于它的Km值。
如[S]体内<
<
Km，则v<
vmax,说明大部分的酶在体内是不起作用的，处于一种浪费的状态；
反之，如[S]体内>
>
Km，v≈vmax,这种底物浓度就失去其生理意义，也不符合实际情况。
7．区分Km与Km/
不能简单的把Km看作没有抑制剂时的米氏常数，而把Km/看作有抑制剂时的米氏常数
8．Kcat/Km可用于
a.比较不同的酶或同一种酶催化不同底物反应的催化效率，Kcat/Km值越大，酶的催化效率越高。
b.检验反应是否达到稳态或平衡态快速反应研究证明酶和底物结合的速度常数为109s-1·
mol-1·
L数量级，如果Kcat/Km为同样的数量级就可以假定为稳态。
9米氏方程中Km及vmax的求法——双倒数方程
要注意底物浓度的选择，不能过大也不能过小，要在Km附近，为什么要在Km附近？
结合米氏方程来讨论
三．抑制作用
酶蛋白分子上的必需基团受化学物质的影响而发生化学性质的变化，并由此引起酶活力的降低或丧失。
这种现象称为抑制作用。
能引起抑制作用的物质称为酶的抑制剂，包括药物、毒物、抗生素、抗代谢物，以及大分子蛋白质，小分子化合物（CO,N3-,CN-等非金属离子，重金属离子）。
2．如何用动力学方法区别可逆与不可逆抑制
具体解释见讲义P21
①一定量的抑制剂与酶混合，预保温一定时间后，取不同量的混合液测定其在固定体积的反应体系中的初速度。
可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别
（一）
1，无抑制剂；
2，有不可逆抑制剂；
3，3，有可逆抑制剂。
②固定反应体系的体积，先在其中加入一定量的抑制剂，再加入不同浓度的酶，测定酶活。
可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别
（二）
3．不可逆抑制剂
以下两种Ks型和Kcat型它们的特点，为什么叫做Ks型？
它指的是酶分子和抑制剂还是有一种亲和性；
而Kcat型，就是结合上去之后，有一个催化反应，把它的潜伏反应集团活化。
①Ks型不可逆抑制剂
⑴结构特征：
a.具有和底物相类似的结构，可以与相应的酶的底物结合部位结合；
b.带有一活泼的化学基团，可以和酶分子中的必需基团起反应，对之进行化学修饰，从而抑制酶的活性。
⑵作用特点：
a.抑制作用是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记，故又称亲和标记试剂。
b.该种试剂一般只对底物结构和其相似的酶有抑制作用，故有一定的专一性。
c.该种试剂的专一性有一定的限度，因其活泼基团还可以修饰酶分子其它部位的同一类基团。
其选择性取决于抑制剂与活性中心必需基团形成非共价络合物的解离常数以及非活性中心同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值。
如果相差3个数量级以上，就可以忽略副反应。
⑶应用：
研究酶活性中心的结构。
在抑制剂上引入某种具有特殊光学性质的基团，而这些基团又可以随着酶分子局部微环境的不同而改变，这种基团就可以作为“报告”基团报告活性部位微环境的性质。
②Kcat型不可逆抑制剂
具有一潜伏反应基团。
⑵作用特点：
a.当酶对抑制剂进行催化反应时，该潜伏反应基团被反应而活化，与活性中心发生共价结合，并使得结合物停留在这种状态，不能再分解生成产物，酶因而致“死”。
b.抑制作用的效率及专一性不但与Ks有关，更重要的是取决于Kcat。
Kcat愈大，Is生成的速度愈快，抑制作用也愈强。
医药及生物防治。
将酶作为靶子，通过设计特定的化合物抑制其活性或使其失活。
4．可逆抑制
每种可逆抑制作用的特点。
竞争性抑制：
不会有三元络合物形成；
非竞争性抑制：
有三元复合物形成；
反竞争性抑制：
抑制剂只可能与结合有底物的酶分子进行结合
各种抑制的例子。
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制；
金属离子与巯基结合以后，再来改变活性中心的构象
5．混合型抑制
它是一个一般的情况，之前三种都是特殊情况。
四．双底物双产物反应动力学分类
掌握下面三个机制的特点，到底有没有三元络合物的形成，乒乓机制没有，前面两个有；
序列有序和序列随机到底是怎样的方式
反应通式：
E+A+B→E+P+Q
（1）反应过程中形成三元络合物E+A+B→EAB→EPQ→E+P+Q
a．序列有序机制：
两种底物按一定的顺序与酶结合，只有当第一个底物与酶结合后，第二个底物才结合上去，产物P和Q的释放也按照一定顺序进行，也即：
b．序列随机机制：
两种底物不按一定的顺序与酶结合，产物也为随机释放，也即：
（2）反应过程中不形成三元络合物—乒乓机制
酶首先与一个底物结合，释放一个产物，而后再与另一个底物结合，再释放出产物，即底物和产物交替地与酶结合或从酶释放，反应过程中无三元络合物形成。
第七节别构酶及其反应动力学
一．别构酶（概）：
由多个亚基组成的，分子中除结合底物并催化底物转化的活性部位外，还有结合别构效应物（别构配体）的部位。
这两个部位位于不同亚基上，也可能位于同一亚基的不同部位。
别构配体与酶结合后，可改变酶分子亚基间的结合状态（疏松或紧密），从而影响酶对底物的结合及酶的催化能力（正或负）。
二．别构酶的结构特点之一：
有时因物理或者化学的变化（如加热、冷冻、尿素等处理），酶会失去对效应物的敏感性，但是催化活性并未失去。
这种脱敏的酶表现出正常的双曲线动力学特征。
脱敏感酶：
别构酶由于构象的改变，对于效应物不在敏感，但本身的催化活性并未失去，正常的双曲线特征是完整的保留着的
三．别构效应类型的判断
1．协同指数：
Rs——反应速度分别达到最大反应速度90%和10%的时候所对应的底物浓度的比例。
Rs>
81为负协同效应；
Rs<
81为正协同效应
2．Hill系数
四．别构效应的动力学模型
掌握两个模型的特点，它们到底强调的是什么东西，用于解释别构效应类型的时候，解释别构效应反应特点的时候，有怎样的适用性。
前提：
1．别构酶的别构效应是由于寡聚酶亚基间的协同作用产生的；
2．每个亚基都有两种不同的构象状态
T状态（Tightstate）：
紧密态，不利于结合底物或调节物。
R状态（Relaxationstate）：
松弛态，有利于结合底物或调节物。
（一）MWC模型（齐变模型，同构模型，对称模型）
1．主要观点：
（1）酶分子中的亚基只可能以一种相同的构象存在，也即不存在RT杂合物，并且T状态与R状态中亚基的排列是对称的；
（2）无配体的时候，T状态与R状态之间存在着平衡。
一当有配体存在时，平衡被破坏。
2．特点：
可以很容易地解释正负调节物的作用，但不适用于负协同效应。
（二）KNF模型（序变模型）
（1）酶分子各个亚基的构象由R状态转变到T状态不是同时进行的，也即RT杂合物是存在的
（2）由T状态转变到R状态是由配基的结合而诱导产生的
（3）配基在KNF模型中可以是正协同效应的，也可以是负协同效应，这取决于配基结合以后对其它亚基的影响
该模型认为酶分子有许多中间构象状态存在，因此用来解释别构酶的酶活性调节作用要比MWC模型更好一些，适用于大多数酶。
特别是在描述异促效应时，一般认为要比MWC模型更好一些。
※无论是MWC模型，还是KNF模型，都只是考虑了最简单的情况，而忽略了其它情况。
因此对于试验结果的解释，始终存在一定的局限性。
五．别构酶的生理调节功能
具体例子不用管，但根据例子所引述的或总结的普遍性的原则要知道，正负协同效应分别有什么功能，别构酶在整个的代谢链条中处于什么位置，因此就决定了它有什么样的特点
1．正协同效应
正协同效应可以使得反应底物浓度在一个很窄的范围内即可快速大量地合成产物，并能调节参与几个不同代谢途径的底物在各个代谢途径中得到合理的分配。
2．负协同效应
负协同效应使得酶促反应速度对低的配体浓度相对不敏感，从而得以保证代谢中某条重要途径在底物浓度较低时能够较为稳定地进行下去。
总之，别构调节是快速影响酶活力的一种重要方式，受到别构调节的酶通常处于代谢途径的起始点或者分叉点，也可能处于代谢途径中部的关键位点或者限速位点上，在体内的代谢调节中有很重要的作用。
第八节pH和温度对酶催化反应速度的影响
一．最适pH：
*最适pH并非酶的特征物理常数，它只能作为一个实验参数。
二．pH对酶稳定性的影响：
①强酸强碱：
不可逆变性失活；
②非强酸强碱：
有时引起可逆变性失活，有时不可逆变性失活。
到底是可逆还是不可逆，如何判断？
保温，最适PH测定，恢复的为可逆，不恢复的为不可逆
三．最适温度：
酶的最适温度也不是酶的特征常数。
四．临界失活温度（概）：
酶在一小时内损失一半活力时的温度，可用于比较不同酶的稳定性。
当它用于比较酶稳定性时，该温度升高说明稳定性增强还是减弱
第九节核酶
一．核酶的典型性例子
1．原生动物四膜虫26SrRNA加工成熟（并不是一个真正意义上的酶）
2．第一个完全意义上的核酶是RNA酶P
3．核糖体的23S肽酰转移酶也是一个核酶
二．自我剪接机制
核酶自我剪接机制所运用的是转磷酸酯反应，即磷酸二酯键断裂后重新形成
三．自我剪切机制酶的结构特点
①一级结构上，具特定的保守序列（酶的活性部位）和剪切点序列（底物）。
②高级结构：
具独特的空间结构和构象。
四．脱氧核酶
脱氧核酶并非催化能力本身就一定要低于蛋白类酶及核酶，即在催化潜能上并不能作出结论脱氧核酶一定低于核酶或蛋白类酶
问题：
通过延长10－23核酶的结合臂的长度，将会对该酶催化底物反应的Km和Kcat产生什么影响？
五．现阶段,蛋白类酶仍然是催化分子的绝对主力（论述）
（一）自然界经过亿万年的进化后所选择的催化分子所具有的特点：
1．组成的元件比较丰富，有利于针对不同的反应形成特定的复杂空间结构；
2．具多种活性基团;
3．能够遗传和变异。
二）目前已经获得的核酶/脱氧核酶与蛋白类酶在催化类型和活力上都相差甚远
1.从蛋白质和核酸本身的化学组成来看，蛋白质比核酸具有更大的催化潜能。
1）蛋白质分子中有许多RNA/DNA中所没有的共价催化基团以及酸碱催化基团；
2）蛋白质分子中还可以形成非极性的活性中心空穴，在这里催化基团被低介电环境所包围。
这样底物分子和酶的催化基团之间氢键及静电相互作用被增强，有助于加速酶促反应；
3）蛋白质骨架的刚性比核酸强，可以折叠成更加紧密稳定的三级结构，有助于形成复杂而稳定的催化构象；
4）蛋白质的组成元件有20种，这样蛋白质就比核酸的组合多样性多出许多数量级。
从中得到可以催化某一反应的顺序的可能性大大增加，同时获得的有催化能力的结构也更为合理。
（
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