植物生物技术.docx

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植物生物技术

绪论

1.植物生物技术的概述：

指生物技术在植物上的应用，包括植物组织培养技术、人工种子、细胞工程、基因工程等多个生物技术，主要是指植物基因工程和与之相关的植物组织细胞培养技术、分子标记育种技术等。

2.生物技术的产生和发展：

现代生物技术是以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志的。

发展迅速

3.植物生物技术的展望：

植物生物技术被普遍认为是未来人类解决资源短缺不可或缺的技术，也是争取农产品高附加值的重要技术手段。

4.WhatisBiotechnology什么是生物技术：

应用该技术通过添加来自另一生物的基因来修饰生物的生物功能

第一章组织培养实验室建设与操作技术

1.标准的组织培养实验室包括：

洗涤室（准备室）、配置室、灭菌室、接种室、培养室、观察室等。

2.组织培养所用到的器具：

镊子类、剪刀类、组培瓶、各类器皿、量筒、移液管、试剂瓶、容量瓶、试管以及移液管架、酒精、玻璃棒、

3.培养基的配制：

无机营养成分、有机营养成分、碳源、激素、琼脂、水。

其中无机营养包括大量元素、微量元素。

有机营养包括氨基酸和维生素。

碳源有蔗糖、葡萄糖、果糖，以蔗糖为主。

激素包括生长素和细胞激动素

4.植物生长调节物质：

生长素：

吲哚乙酸、NAA、2,4-D；细胞分裂素：

控制植物细胞分化（比例高时——产生芽,比例低时——产生根）、赤霉素、脱落酸

作用：

促进细胞生长和细胞分裂；

•诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力；

•形成愈伤组织，促进生根；

•与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。

5.根据培养物的培养过程，培养基分为：

初代培养基：

用来第一次接种外植体的培养基；继代培养基：

用来接种继初代培养物的培养基。

根据其作用不同，培养基分为：

诱导培养基；增殖培养基；生根培养基。

6.基本培养基：

主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。

7.完全培养基：

基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。

8.培养基的配制：

计量、移液、取琼脂蔗糖备用、融化、混合、调pH、分装、包扎、培养基的灭菌

9.灭菌工作的重要性：

预防感染杂菌的需要；消除生物污染的需要；防腐与保存的需要

10.灭菌的方法：

a、物理方法：

干热、湿热、过滤（0.25微米）紫外灯、超声波等。

b、化学方法：

使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等。

11.干热灭菌：

适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。

操作方法：

150℃、40min或120℃、120min，如果发现芽孢杆菌，160℃、90～120min。

12.湿热灭菌：

适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。

121℃维持20～30min。

注意点：

加足水、排尽气、气压降到0时，才能开盖

13.过滤灭菌：

培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。

另外酶、血清等也需要过滤灭菌。

灭菌方法：

将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.22～0.45微米。

制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量的激素，然后分装。

14.射线灭菌：

主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20～30min。

15.火焰灼烧灭菌：

用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。

16.消毒剂

消毒剂

使用浓度（%）

消毒时间（min.）

效果

残液去除难易

乙醇

70-75

0.1-3

好

易

氯化汞

0.1～1

2～15

最好

最难

过氧化氢

10～12

5～15

较好

最易

抗菌素

4～50mgl-1

30～60

较好

较难

次氯酸钙/纳

9～10

5～30

好

易

1.无菌操作技术

17.实验器具和材料的准备

用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。

注意：

台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。

关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。

进入接种室。

（注：

没有特别情况，尽量不要下工作台）

18.外植体和外质体的灭菌：

取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。

打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。

用酒精擦洗工作台和手。

进行下一轮操作。

19.无菌操作的注意事项

（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。

（2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

（3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。

（4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。

同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。

（5）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。

第二章胚胎培养

1.植物胚培养：

是指在无菌条件下，对植物的胚及胚器官如子房、胚珠和胚乳进行离体培养的技术。

2.植物胚培养的类型：

成熟胚培养：

成熟胚为子叶期以后的胚，其在简单的培养基上即可萌发生长

3.成熟胚培养过程：

种子——95%酒精消毒——选取完好种子——70%酒精浸数S——0.1%升汞或10%次氯酸钠浸泡——无菌水冲洗——种子培养几天——剥离种胚——接种在培养基上（MS、White培养基）

4.成熟胚培养条件下：

（1）因成熟胚本身含有较多的营养条件，对培养基要求不高

（2）只含有大量元素和糖的培养基上，便可萌发成苗

（3）多数植物成熟胚的生长以12h/天光照为宜。

5.幼胚培养：

（子叶形成之前）对发育早期的胚进行培养。

培养技术和条件要求较高。

需要通过培养基向其提供足够的营养物质。

6.看护培养（nurseculture）：

将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。

7.影响胚培养的因素

培养基：

无机盐、碳水化合物、植物激素的作用、天然提取物及某些蛋白制品、氨基酸和维生素、活性炭和PH

环境条件：

温度、光照、pH、培养基形态

胚龄：

胚的发育程度与萌发成活率呈正相关，胚的剥离以受精35天左右为宜；心形胚和鱼雷胚较好

8.胚珠培养：

是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。

9.胚珠培养类型:

未受精胚珠的培养和受精胚珠的培养

10.胚珠培养的基本过程：

胚珠的获取；培养条件；受精胚珠的发育

11.子房培养：

将子房从母株上摘下，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。

根据培养的子房是否授粉分为：

授粉子房培养；未授粉子房培养

12.子房培养的过程：

子房的获取；子房的培养

子房性细胞——愈伤组织或胚状体——单倍体植株

子房体细胞——愈伤组织或胚状体——二倍体植株

13.胚珠和子房培养的应用

（1）受精胚珠培养目的：

一是打破种子的休眠；二是挽救胚的发育，以获得杂交种。

（2）未受精胚珠培养目的：

获得单倍体植株。

（1）授粉子房培养目的：

挽救子房杂种胚的发育

（2）未授粉子房培养目的：

获得单倍体植株；试管受精解决杂交育种中不亲和问题。

14.影响胚珠和子房培养的因素

a）基因型

b）发育时期：

越早培养基越复杂

c）附带组织：

花的其它器官。

d）附加成分：

外源激素等

15.胚乳培养：

是指将从母体上分离出来，在无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。

16.胚乳培养过程

胚乳外植体制备:

种子消毒---取出胚乳

培养:

White或MS诱导培养基---25-27℃--暗或弱光

发育:

诱导形成愈伤组织----再分化形成胚状体或不定芽---生根培养----植株。

17.胚乳培养的应用

获得三倍体植株，用于育种利用。

三倍体植株具有营养体大，无籽等特点。

如无籽西瓜。

胚乳培养也会产生较多的混倍体，影响育种利用。

但可用于染色体工程研究。

✓稳定型：

三倍体

✓畸变型：

除少数是三倍体，多数是由多种倍性细胞组成的嵌合体

18.植物离体授粉：

将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管实现受精的技术。

19.离体授粉的类型

（1）.离体柱头授粉（授于离体雌蕊的位置）

（2）.离体子房授粉

（3）.离体胚珠授粉

第三章植物愈伤组织的诱导与分化培养

1.植物的全能性：

植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力

2.植物组织培养：

就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。

3.愈伤组织：

植物外植体脱分化、经过细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。

4.愈伤组织培养：

是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。

5.愈伤组织培养的调控因素：

外植体、培养基和培养环境。

6.从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：

诱导期、分裂期和分化期。

7.形态建成：

外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。

8.愈伤组织的形态发生方式:

不定芽方式和胚状体方式。

9.愈伤组织的形态发生：

外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。

10.胚状体（embryoid）：

指在组织培养中，由一个非合子细胞（体细胞），经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。

11.愈伤组织的培养条件：

温度、光照、湿度、培养基组成、PH值、渗透压。

12.试管苗移栽时注意事项

（1）.试管苗驯化和炼苗：

瓶驯化；瓶外驯化—定值到育苗容器和苗床，经过一段时间的保湿和遮光处理。

（2）.根处理：

蘸生长素（50mg/LNAA）和生根粉处理。

（3）.选无风阴湿天气移苗。

（4）.基质湿度不宜太高，基质水分过多，通气不良影响生根。

13.植物器官的培养的分类

14.植物组织培养的应用

1）如利用茎、叶和花器培养建立的试管苗，可在短期提高繁殖速率，进行名贵品种的快速繁殖；

2）利用茎尖培养可得到脱毒试管苗，解决品种的退化问题，提高产量和质量；

3）将植物器官作诱变处理，用器官培养可得到突变株，进行细胞突变育种

第四章茎尖培养和离体快繁

1.类型及意义：

类型：

1）微茎尖（茎尖分生组织）培养：

指带有1～2个叶原基的生长锥，其长度不超过0.5mm。

目的是获得无病毒植株

2）普通茎尖培养：

指对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养。

目的是快速繁殖。

技术简单,操作方便,易成活和分化,成苗时间短。

意义：

无性系快速繁殖；培养无病毒苗，品种改良；理论基础研究。

2.茎尖培养方法

1）制备外植体：

取1-2cm的枝条顶梢，去小叶---消毒---解剖镜下用解剖刀除去幼叶和叶原基，露出生长点，切下0.1-0.2mm长的茎尖（含1-2个叶原基）

2）组织分离：

用消毒的镊子将材料转到解剖镜下，一手用镊子将其按住，一手用灭菌后的解剖针将叶片叶原基去掉，露出生长点，切下顶端0.1-0.2mm长的茎尖来培养；若为快速繁殖，也可取0.5-1cm长的茎尖．

3）培养基：

一般为MS培养方法：

固体培养