新型人转录因子hBKLF对K562细胞增殖分化及血红蛋白合成作用的研究.docx

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新型人转录因子hBKLF对K562细胞增殖分化及血红蛋白合成作用的研究

新型人转录因子hBKLF对K562细胞增殖、分化及血红蛋白合成作用的研究

【摘要】　　孕22周的胎肝是胎儿的主要造血器官，其中含有大量与造血相关的调控因子。

人碱性Krüppel样因子（humanbasicKrüppel-likefactor,hBKLF）是本研究室从这一时期胎肝cDNA文库中新克隆的转录因子。

对其C端的结构分析发现，它含有3个特征性C2H2锌指结构，因此属于KLF转录因子家族。

前期的表达谱研究工作显示，hBKLF在成人外周血白细胞、骨髓和胎肝中表达量高，在红系中有表达，这提示它可能与造血相关。

本研究以K562细胞为模型，研究hBKLF与造血细胞增殖、分化及血红蛋白合成的关系。

构建hBKLF正义及反义真核表达载体，转染K562细胞，经G418筛选4周，得到稳定细胞株；用RT-PCR、Westernblot方法测定转染后K562细胞hBKLF表达水平的变化；以转染空质粒的K562细胞为对照组，在显微镜下直接观察转染正义质粒和反义质粒的两组细胞形态的改变；用MTT法比较增殖速率的变化；用甲基纤维素半固体培养法比较集落形成率的差别；用苯息丁法观察氯高铁血红素诱导K562细胞分化后血红蛋白合成水平的差异。

结果表明：

正义质粒和反义质粒经NcoI酶切鉴定构建正确。

转染正义质粒的K562细胞中hBKLF的mRNA及蛋白质表达水平增加，转染反义质粒的K562细胞中hBKLF的mRNA水平降低。

增殖活性在反义组、正义组、对照组分别为±、±、±，反义组K562细胞的增殖速率加快，正义组细胞增殖速率减慢。

细胞形态在各组间无明显区别。

集落形成率在反义组、正义组、对照组分别为148±13、136±10、141±10，各组间无显着差异。

3组细胞血红蛋白合成水平在hemin诱导后均升高，诱导后血红蛋白升高倍数在对照组、反义组、正义组分别为±、±、±，反义组K562细胞合成血红蛋白能力增加，正义组合成血红蛋白能力下降。

结论：

hBKLF可以抑制K562细胞的增殖，对血红蛋白合成有负调控作用，但未观察到hBKLF对细胞形态及克隆形成率的影响。

【关键词】hBKLF血红蛋白;K562;细胞增殖;细胞分化

　　EffectoftheNewHumanTranscriptionFactorhBKLFontheProlifera-tion,DifferentiationofK562CellLineandHemoglobinSynthesis

　　DepartmentofHematology,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China;1DepartmentofGenomicsandProteomics,InstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,ChineseNationalHumanGenomeCenteratBeijing,Beijing100850,China

AbstractThehumanbasicKrüppel-likefactor　isanewlyclonedhumantranscriptionfactorfromthecDNAlibraryoffetalliver.ItbelongstotheKrüppel-liketranscriptionfactorfamily.Previousexpressionstudyshowedthatitisahematopoieticrelatedfactor.ThisstudywasaimedtoinvestigatetheeffectofhBKLFoncellproliferation,differentiationandhemoglobinsynthesisbyusingK562celllineasmodel.ThesenseandantisenseexpressionplasmidsofhBKLFwereconstructed,andtransfectedintoK562cellsbylipofectamine.AfterG418selectionfor4weeks,thecelllinewithstableexpressionofthegenewasobtained.ThenthehBKLFexpressionlevel,proliferationability,colonyformationandhemoglobinproductionweredetectedbyRT-PCRandWesternblot,MTTmethod,methylcellulosesemisolidculturemethodandbenzidinetestrespectively.Themorphologicchangeofcellwasobservedwithinvertedmicroscope.TheresultsshowedthatthesenseplasmidcouldincreasehBKLFlevelandantisenseplasmidcoulddecreasehBKLFexpression.WhenhBKLFlevelwasdown-regulated,K562cellscouldproliferatemorequicklyandsynthesizemorehemoglobin.Buttherewerenodifferencesincolonyformationabilityandnoapparentmorphologic　isconcludedthathBKLFcaninhibithematopoieticcellproliferationandhemoglobinsynthesis.ItissuggestedthathBKLF

playsanimportantroleintheproliferationanddifferentiationofhematopoieticcells.

　　KeywordshBKLF;hemoglobin;K562;cellproliferation;celldifferentiation

　　人碱性Krüppel样因子筛选，每3天换液1次，筛选4周，获得稳定细胞株。

用有限稀释法将多克隆细胞以1个细胞/孔接种于96孔板进行单克隆化。

COS-7细胞用含10%小牛血清的DMEM于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

转染时，将2×105/孔对数期细胞接种于6孔板中，培养过夜，至70%-80%融合，每孔加入2μg质粒与10μlLipofectamine的混合物，继续培养7-9小时后换液，转染后24-48小时收获细胞。

　　蛋白表达的Westernblot测定

　　细胞用冰预冷的1×PBS洗2遍，按每孔500μl加入冰预冷的RIPA（1×PBS，%SDS,%脱氧胆酸钠，1%NP-40），冰上慢摇20分钟后，将细胞刮下，4℃，12000×g离心10分钟，保留上清。

蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳分离后转膜，电流按mA，转膜2-3小时，于TBSTM（5%脱脂奶，%吐温20）中4℃封闭过夜，用TBST（%吐温20）漂洗10分钟，共3次，加辣根过氧化物酶标的抗myc抗体，室温慢摇1小时，TBST漂洗3次后，TBS漂洗1次，ECL显色5分钟，压片2分钟。

　　mRNA表达的RT-PCR检测

　　常规方法提取细胞RNA，按AMV高效逆转录试剂盒说明书，取1μg总RNA逆转录为cDNA，RT-PCR比较hBKLF表达量的改变，循环参数同前。

设GAPDH为参照，引物为P5：

5′-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3′，P6：

5′-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3′。

　　MTT试验

　　取对数期细胞，以3×104/ml重悬，按每孔200μl接种于96孔板中，培养48小时后每孔加入MTT15μl，继续培养4-6小时后每孔加入100μl含　NHCl的10％SDS，室温振荡溶解8小时，用酶标仪于570nm处测定吸光值。

每个实验组重复5孔，求平均值作为各组的MTT值。

　　集落形成率

　　取对数期细胞，以1×104/ml重悬，按每孔100μl接种于6孔板中，同时加入1mlRPMI1640，1ml胎牛血清，1ml％甲基纤维素。

充分混合，培养7天后于倒置显微镜下计数集落数。

每个实验组重复3孔。

　　细胞形态学观察

　　取细胞直接于倒置相差显微镜下观察。

　　血红蛋白测定

　　细胞悬液用1×PBS洗2遍后用去离子水重悬，反复冻融3次，室温15000×g离心45分钟，取100μl上清采用苯息丁法测定血红蛋白含量。

每个实验组重复3孔。

苯息丁法测定游离血红蛋白：

设立空白管、标准管、测定管，按顺序于小杯中加入1％苯息丁ml、样品ml、1％H2O2　ml，室温下静置20分钟，然后加入10％醋酸5ml，静置10分钟后测定520nm处吸光值。

按公式计算样品血红蛋白含量。

样品中血红蛋白浓度＝×标准管血红蛋白浓度×稀释倍数。

　　统计学处理

　　MTT值、克隆形成率、血红蛋白升高倍数以平均值±标准差（X±SD）表示，各组细胞间的均值采用方差分析，均数间的多重比较采用Dunnett-t检验。

　　结果

　　hBKLF正义及反义表达载体的构建

　　选择/myc-hisC质粒作为真核表达载体，使插入的基因以带有myc-his标签的融合蛋白形式表达出来，便于用myc抗体检测表达产物。

为了构建正义质粒，根据hBKLFcDNA序列设计正义引物，扩增其完整ORF序列，正义引物使读码框与myc/his标签蛋白一致，正义下游引物不加终止密码子，利用载体上终止密码子，预期获得1063bp片段。

反义引物扩增跨越起始密码子ATG的N端564bp片段。

引物的两端带有HindⅢ/XhoⅠ酶切位点，但将其酶切位点进行对调，以便反向插入载体中。

以上两对引物的PCR扩增产物连入/myc-hisC载体的HindⅢ/XhoⅠ多克隆位点，获得的正义及反义重组质粒经酶切及测序鉴定正确。

　　为了鉴定hBKLF正义质粒是否能正确表达hBKLF/myc-his融合蛋白，将其转入COS-7细胞，提取COS-7细胞在/myc-his-hBKLF质粒转染前后的总蛋白，采用Westernblot方法用myc抗体检测。

结果显示，转染前细胞中无hBKLF/myc-his融合蛋白，转染后细胞中出现预期的41kD条带。

这表明hBKLF的正义质粒可以表达完整的hBKLF蛋白。

　　达hBKLF正义及反义基因的K562细胞株的建立

　　为了观察hBKLF对K562细胞增殖、分化、血红蛋白合成的影响，分别用空质粒、hBKLF正义质粒、hBKLF反义质粒转染K562细胞，于800μg/mlG418中筛选4周，出现了稳定转染的K562细胞，单克隆化后分别提取各组细胞的总RNA，用RT-PCR方法检测hBKLF表达水平。

为了提高比较的灵敏度，分别在PCR的22、26、30个循环时取扩增产物，比较各组在不同循环数时hBKLF的水平，结果如图3。

由图3可以看到，正义细