全糖化血红蛋白测定的原理与仪器解析.docx

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全糖化血红蛋白测定的原理与仪器解析

全糖化血红蛋白测定的原理与仪器解析

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糖化血红蛋白（HbA1c）测定的原理方法与

仪器解析及临床意义

糖尿病目前在世界上发病率很高，占免疫病的比率，在发达国家高达2-5%，而我国糖尿病的发病率亦达2-3%，并且每年还以1‰的速度增长。

糖尿病是一种终生性疾病，其并发症是至残至死的主要原因，所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。

临床上广泛采用血糖参数来判定糖尿病，而血糖参数只代表抽血时的血糖水平，对确诊有局限性。

近年来的医学研究证明：

血液中的糖化血红蛋白（HbA1c）浓度相对稳定，其浓度值能准确反映最近1-3个月期间的血糖水平，便于医生对糖尿病进行早期诊断；也可用于糖尿病人的血糖监控及慢性并发症的判断等，受到临床的广泛重视，目前我国各大、中型医院正逐渐开展糖化血红蛋白（HbA1c）占总血红蛋白（Hb）的百分含量的测定项目。

有些发达国家已将HbA1c的测定列入中老年人的常规体检项目。

测定HbA1c比较常用的方法，目前有乳胶凝集反应法和离子交换高压液相色谱法两种，分别用生化分析仪和糖化血红蛋白自动分析仪进行测定。

1　HbA1c的临床意义

　　糖化血红蛋白是一项说服力较强、数据较客观、稳定性较好的生化检查，不受偶尔一次血糖升高或降低的影响。

能反应糖尿病患者2-3个月以内的糖代谢状况，同时与糖尿病并发症尤其是微血管病变关系密切，在糖尿病学上有重要的临床参考价值。

1．1　增高：

测定HbA1c可以了解糖尿病人在2～3个月的血糖控制情况。

此外，用含葡萄糖的透析液作血透的慢性肾衰病人，地中海贫血和白血病病人亦增高。

1．2　降低：

溶血性及失血性贫血，慢性肾衰，慢性持续性低血糖症等。

1．3　作为糖尿病的病情监测指标

1．3．1　作为轻症、Ⅱ型、“隐性”糖尿病的早期诊断指标。

1．3．2　不是诊断糖尿病的敏感指标，不能取代现行的糖耐量试验。

1．3．3　可以列为糖尿病的普查和健康检查的项目。

1．4　当HbA1c＞9％时，说明患者存在着持续性高血糖，可以出现糖尿病肾病、动脉硬化、白内障等并发症。

临床经常以糖化血红蛋白作为监测指标来了解患者近阶段的血糖情况，以及估价糖尿病慢性并发症的发生与发展情况。

1．5　对预防糖尿病孕妇的巨大胎儿、畸形胎、死胎，以及急、慢性并发症发生发展的监督具有重要意义。

1．6　对于病因尚未明确的昏迷或正在输注葡萄糖（测血糖当然增高）抢救者，急查糖化血红蛋白具有鉴别诊断的价值。

1．7　对于糖化血红蛋白特别增高的糖尿病患者，应警惕如酮症酸中毒等急性合并症的发生。

2　临床常用的测定糖化血红蛋白HbA1c的方法

2．1　乳胶凝集反应法

　　乳胶凝集反应法是利用抗原抗体直接测定总血红蛋白Hb中的糖化血红蛋白HbA1c的百分含量。

目前有国内外几家厂商可以提供HbA1c测定的试剂盒。

这种免疫反应是由被测血样品中的总Hb和HbA1c与试剂中的抗体结合而形成凝集，凝集量随HbA1c浓度的大小而变化。

使用生化分析仪器来进行比浊测定HbA1c的浓度，采用终点法，生化仪通过测定反应液的吸光度值，可直接反映出凝集量的多少；推算出HbA1c占Hb的百分含量，测定时，仪器多采用660nm单色光做主波长，800nm单色光做副波长，通过标准曲线得出实测值。

由于这种试验其标准曲线是非线性的，所以在测定前，首先用随试剂盒一起带有的5种不同浓度的定标液，做出5点非线性标准曲线。

曲线和数值存在生化仪的贮存器中，测定样品时，实测出的吸光度值A与标准曲线比较，由仪器CPU求出实测样品中的HbA1c百分含量。

乳胶凝集反应法测定HbA1c简便、不用增加仪器，可直接用自动生化分析对样品进行快速测定。

该方法也可以用手工的方法，在酶标仪进行测定，是目前使用较多的方法。

但是乳胶凝集反应法其准确性和重复性均有欠缺。

2．2　离子交换高压液相色谱法HPLC

　　使用离子交换高压液相色谱HPLC（highpressureliquidchromatography）来测定HbA1c的百分含量目前被认为是分析HbA1c的金标准。

采用HPLC方法工作的全自动糖化血红蛋白分析仪器，以其快速、简便、精巧、准确等特点，受到越来越多用户的欢迎。

　　色谱分析是一类利用混合物的各组分在不同相上的分配差别，在两相物质相对运动过程中，将混合物中的各种成份分离开的一种分析技术。

液相色谱是以液体或固体为固定相，以液体为液动相的色谱法的总称。

色谱法又叫色层或层析，这一技术在生命科学研究中用于生物活性物质的分析；生物活性物质是以混合物形式存在，人类血液中的蛋白质有上千种，只有把混在一起的被测蛋白分离出来，才能准确测定；在HbA1c的测定时，可以通过高精度HPLC，将HbA1c从Hb中分离出来，才能得到准确的数值。

在生命科学研究中，活性物质的分离主要应用的是液相柱色谱。

这种技术诞生于20世纪初叶，俄国化学家茨维特把植物色素混合液置于装有碳酸钙吸附剂的玻璃管顶端，用石油醚洗脱后，在玻璃柱上出现了几组颜色不同的色带，这些色带随着不断的洗脱，越分越开，先后从玻璃柱下端流出，茨维特把这样一种用流体洗脱色素混合液，使之通过碳酸钙做固定相从而实现分离的技术，起名叫“色谱法”。

这种方法被推广用于分离许多混合物中的各种物质，被分离物质已和颜色无关了，但“色谱”分析的名称仍沿用至今。

当然更贴切的名称应该叫“层析法”。

早期的“色谱柱”体积大，做固定相的物质颗粒大，分离时需要大量的洗脱液。

并且洗脱液靠重力流动，分离时间长，效率低。

随着科学技术的进步，20世纪60年代，人们研制出新型液相柱，同时采用高压输液泵自柱上端为洗脱液加压，大大加速了洗脱液的流速，开发出相应的高灵敏度的检测器，新的分析仪器—高压液相色谱仪在70年代诞生，很快就占领了分析化学的舞台。

特别是在生命科学的研究中，HPLC技术由于对被测物活性影响小，几乎可以测定生物医学中所有的非发挥性物质，如近年来利用离子交换HPLC法测定血液中的HbA1c的百分含量，被认为是糖尿病诊断的金标准。

3　糖化血红蛋白自动分析仪

　　糖化血红蛋白自动分析仪采用离子交换HPLC法测定HbA1c。

离子交换HPLC法，是利用能交换离子的材料为固定相来分离离子型化合物的方法。

仪器使用阳离子交换柱进行HbA1c的百分比测定；当一定量的全血样品被取样针吸入到进样装置内，在稀释部分被溶血，释放出红细胞中的血红蛋白Hb，并由稀释液稀释，稀释好的已经溶血的样品，由高压泵注入离子交换柱。

柱内的固定相是最新开发的非多孔性，不溶和可渗透的交联高聚物，上面分布固定的带电荷基团和能游动的配衡离子；样品通过过滤器从交换柱顶端加入后，由三种不同浓度的盐洗脱缓冲液（流动相）洗脱，使样品向下移动。

此时溶液中所含血红蛋白（Hb）的各种组份即与固定相上能移动的离子进行交换，样品中的血红蛋白多种组分在固定相上连续进行可逆的交换吸着和解吸作用，而3种不同离子浓度的盐液，形成线性梯度洗脱，洗脱液No1叫起始缓冲液，含低离子浓度的盐，洗脱液No2、No3缓冲液，其离子浓度依次增高很多，这种流动相离子浓度的改变对分离效果的影响非常明显，前面洗脱出来的组分分离效果好，色谱峰很窄，后面组分也能在很短时间内洗脱出来，大大缩短了分离时间；所以全自动血红蛋白分析仪，在1分多钟内、Hb中的多种成份被分离成6个部分，其中的HbA1c、HbF、HbA1被有效、精确的分离；由交换柱流出的Hb成分到达仪器的检测器，检测器内装有发射单色光的发光二极管，通过双波长可见光比色法测定HbA1c、HbF、HbA1三个参数。

仪器的检测器检测出分离后HbA1c、HbF、HbA1组分的吸光度值，与HbA1c标准品吸光度值比较，分析计算出结果，最后以百分率表示的Hb组分结果与色谱图一起打印出来。

离子交换柱HPLC法对全血直接测定HbA1c，其批内和批间变异系数CV均可以小于1%（CV<1%），结果精确，HbA1c检测结果不受存在的变异型血红蛋白及其衍生物的影响，特别适合于糖尿病人的监控。

关于糖化血红蛋白的不同的测定方法与正常值之间的关联！

由于现在糖化血红蛋白测定方法不同，标注的正常值也不同，不光患者糊涂，临床工作中也不方便。

现在糖化血红蛋白的测定方法有5种：

（1）离子交换高效液相色谱分析法－检测糖化血红蛋白HbA1c的金标准；

（2）电泳法；（3）微柱法；（4）亲和层析法；（5）免疫法。

比如我们医院以前用的是免疫法，正常值是5%-7%，现在用的是微离子柱层析法（机器型号是DREWDS5），正常值是6%-8%，请教大家这些不同的测定方法得到的测量值之间是否有一定的比例关系？

国际上有没有糖化血红蛋白测定的统一标准（测量方法及测量值）。

糖化血红蛋白（Glycatedhemoglobin,GHB）实验通常是检测由血红蛋白和葡萄糖经缓慢过程且非酶促反应所形成的稳定部分，其合成速率与红细胞所处环境中糖的浓度成正比,积累并持续于红细胞120天生命期中。

由于红细胞允许葡萄糖自由渗透，血液样本中糖化血红蛋白水平反应过去120天内的平均血糖水平。

GHB检测用于常规实验室始于二十世纪七十年代末期，且稳定发展至今，成为评价血糖控制水平的重要指标。

临床实验室中应用的GHB检测方法主要分为两大类，一类方法基于GHB与非GHB的电荷不同，如离子交换色谱、电泳和等电聚焦方法；另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点，如亲和层析和免疫实验，每种方法各有优缺点，对临床实验室而言，尚无“最佳”方法可以选择。

虽然方法不同，结果的表示不同，但在正确操作和解释的情况下，方法间可以有较好的相关性，并能为临床提供有用的信息。

目前在美国进行的糖尿病控制和并发症临床研究（diabetescontrolandcomplicationstrial,DCCT），表明了糖尿病患者病程的发展和合并症与血糖控制的密切关系，及血浆葡萄糖水平与HbA1c水平间的关系。

在此基础上，美国糖尿病协会（AmericanDiabetesAssociation）提出了糖尿病治疗的建议，指明测定HbA1c重要性，并在世界范围内被广泛应用。

为了更好地应用DCCT的结果治疗糖尿病人，为临床医生提供准确的实验室数据，美国临床化学协会（AACC）在1993年成立分委会进行GHB测定的标准化工作，使不同实验室（方法）的结果可溯源至DCCT的参考结果。

标准化工作由美国国家糖化血红蛋白标准化计划（NationalGlycohemoglobinStandardizationProgram,NGSP）指导委员会于1996年完成。

这一工作使得美国临床实验室间GHB测定的结果有了大的变化：

2000年，90%实验室以HbA1c报告糖化血红蛋白的结果，所有参加NGSP活动实验室测定结果的室间C小于5%，HbA1c结果与靶值的偏差小于0.8%。

目前，美国绝大多数实验室报告的结果，均可溯源至DCCT结果，使对糖尿病及其并发症的治疗和预防工作有了统一的参考标准。

美国临床实验室标准委员会（NCCLS）采纳了NGSP的GHB测定的标准化模式。

一、NGSP实验室网络

NGSP由执行委员会和实验室网络组成（图1）。

实验室网络中包括管理核心（NETCORE），一级中心参考实验室（CPRL），一级参考实验室（PRLs）和二级参考实验室（SRLs）。

管理核心（NETCORE）负责直接与执行委员会联系，分析全部网络监测数据并转送执行委员会审批，向合格的实验室或厂家颁发证书。

一级中心参考实验室依据在DCCT项目中使用的方案[5]，使用Bio-Rex70树脂HPLC方法测定HbA1c，建立基准。

虽然，采用的方法有一定缺限（如受HbF、变异血红蛋白的干扰，且测定速度较慢），但长期稳定性（Cs﹤3%）是NFSP考虑其作为参考方法的主要依据。

一级参考实验室