骨髓基质干细胞成骨的研究进展文档格式.docx

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BMSCs的数量随着年龄的增加也不断减少，鼠在21个月时股骨干骨髓中的细胞要少于4个月时的骨髓细胞。

BMSCs在骨髓中含量极少（1×

105个单核细胞中含有1个BMSCs），因此要求在体外培育扩增后，才能达到组织工程学所要求的细胞数量。

在抽取骨髓血的进程中，每一个部位抽出量不该超过2mL，不然将因抽出物中血量增加而引发有核细胞数的明显下降。

　　经常使用取得BMSCs的方式有：

a）贴壁法。

所得细胞成份复杂，BMSCs的纯度不足；

b）密度梯度离心法。

该方式基于沉降作用，这是较简便且有效的分离方式，它能有效地将红细胞、白细胞和间充质细胞分离开来。

Lisignoli［1］研究发觉，密度梯度离心法能增加BMSCs分化成为成骨细胞克隆的数量；

c）流式细胞仪法；

d）免疫学方式。

免疫选择法通过骨髓基质干细胞表面带有或缺乏某些抗原标志，进行挑选，可取得相对纯化的基质干细胞。

赵子义等［2］研究发觉，利用免疫磁珠标记神经生长因子受体（nervegrowthfactorreceptor，NGFR）抗体分离、纯化而取得NGFR＋MSCs比一样培育条件下贴壁法纯化BMSCs其扩增倍数高出2～3个数量级，而且其内含有更高比例具有多向分化潜能的细胞，因此分离骨髓NGFR＋细胞取得的BMSCs作为种子细胞应用于组织工程具有明显优势。

但到目前为止，BMSCs的特异性表面抗原标志仍没有明确，而且缺少选择性分离BMSCs的方式。

　　2骨髓基质干细胞的体外增殖生物学特性

　　对BMSCs细胞周期的研究说明，其大约有20％处于静止期，即G0期细胞，这说明BMSCs具有壮大的增殖能力，可是有文献报导，高度传代（大于25代）的BMSCs中有一部份已经表现出凋亡的特点。

BMSCs接种密度的大小直接阻碍BMSCs的增殖能力，低密度接种（5000/cm2）BMSCs不管在扩增速度仍是扩增倍数上都明显高于高密度接种，而极低密度接种～12/cm2）更有利于细胞的增殖。

杨柳等人［3］在实验中也发觉种植密度较高时，严峻阻碍BMSCs的贴壁生长，考虑为含有的红细胞、白细胞比重大于BMSCs而第一沉积于瓶底，且细胞代谢废物增多所至。

　　BMSCs成骨活性随着供体年龄增加呈下降趋势，年龄越大，在培育中形成的群落和具有成骨样细胞特点的细胞越少，而且细胞对诱导因子的反映灵敏性下降。

　　低氧张力条件下BMSCs培育，其细胞增殖速度大大提高，且细胞ALP表达也大大增强［4］。

考虑其缘故为机体内部的氧分压明显低于外界（140mmHg），专门是骨髓内氧分压只为30～50mmHg，大约相当于外界的1/3，因此BMSCs长期暴露于高氧分压的状态，必将致使细胞过度氧化，功能下降。

若是体外进行培育的条件与体内氧分压相似，那么更有利于细胞功能的保留。

　　顾祖超等人［5］在实验中发觉，兔BMSCs原代培育，其开始贴壁（1～2d）的时刻和完全贴壁时刻（12～14d）均擅长传代培育的BMSCs。

传代BMSCs不形成集落，形态加倍单一，呈梭形，14d之内没有形成明显钙化结节。

BMSCs经诱导培育后的形态要紧为多角形，其贴壁率有所下降，且在10～12d之内形成明显钙化结节。

传代细胞和诱导细胞二者的生长曲线无统计学不同，倍增时刻为～h，生长顶峰均在接种后6～7d显现。

BMSCs长满单层后，可显现多层生长，没有发生接触抑制。

　　Sun等人［6］的研究还发觉大鼠BMSCs抑制T淋巴细胞的扩增，以为此特性可使其应用于同种异体移植。

Cancedda［7］指出，通过体外扩增，BMSCs在体内的成骨效率明显低于新鲜的骨髓，其在体外的多项分化潜能慢慢消失。

　　3骨髓基质干细胞的诱导分化

　　由于BMSCs具有分化多方向性的特点，而骨组织工程学要求其向单一方向分化，因此BMSCs的定向诱导具有重要作用。

就其成骨方向来讲，具有诱导作用的有以下几种因素。

　　化学物质的作用

　　地塞米松（Dex）Beresford等［8］发此刻原代及传代细胞培育中均加入地塞米松时，骨髓基质细胞向成骨细胞及脂肪细胞转化，在传代培育中再加入1，25二羟维生素D3，那么抑制其向脂肪细胞转化，通过骨钙蛋白mRNA分析证明向成骨细胞转化占优势。

而仅在传代培育中加入地塞米松时，骨髓基质细胞多向脂肪细胞转化。

　　而Maniatopoulos［9］以为只有在地塞米松和β甘油磷酸钠存在的培育环境下，才能形成矿化骨样小结，形成矿化小结的时刻、形状、数量与地塞米松加入的时刻及剂量有关。

　　1，25羟基维生素D3（1，25（OH）2D3）Kelly等［10］发觉1，25（OH）2D3在增进BMSCs向成骨细胞分化的同时，能够抑制由糖皮质激素诱导的脂肪细胞分化。

Faucheux等［11］研究说明，1，25（OH）2D3增进BMSCs中骨钙素水平升高，同时刺激BMP3mRNA的表达，这种刺激在原代培育的BMSCs较已分化BMSCs更强。

　　细胞因子的作用

　　许多细胞因子如骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）、碱性成纤维细胞因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）、转化生长因子β（transforminggrowthfactorβ，TGFβ）等在BMSCs分化及增殖上起着重要的作用。

　　BMPBMP是强有力的诱导因子之一，能够启动BMSCs的成骨进程，可能是诱导BMSCs向成骨细胞系转化的大体信号因子，诱导成骨最强的是BMP二、4、7。

Rickard等［12］研究说明BMP2能够快速诱导BMSCs向成骨细胞转化，作用8～10d观看到BMP2可明显增进BMSCs形态转变，并可提高BMSCs的ALP、骨涎蛋白、骨钙蛋白的mRNA的表达。

同时指出，单独利用BMP的作用较联合利用地塞米松的骨诱导活性低，从而以为BMP可能并非能单独起作用，在整个骨诱导进程中可能需要激素的协同作用。

而Kim等［13］以为BMP2可明显加速BMSCs向成骨细胞转化，但却不能增进骨钙蛋白的分泌，以为BMP可增进成骨细胞前体细胞向成骨细胞转化，但不能使之向成熟成骨细胞转化。

　　bFGFbFGF能够增进BMSCs体外培育成纤维细胞集落的形成，增进细胞的增殖，但对BMSCs的转化作用仍存在不同的研究结果。

Hanada等［14］以为在地塞米松存在的培育环境中，bFGF作用6d时可显著增加细胞增殖，同时骨钙蛋白表达、骨矿化结节形成。

BMP2的促转化作用不如bFGF明显，二者联合应历时促BMSCs转化作用强于单一因子。

而Martin等［15］研究说明在众多生长因子中bFGF对BMSCs具有最强的促割裂作用，同时经bFGF作用的细胞植入体内表现出较强的成骨能力。

　　TGFβTGFβ是较强的促成骨分化的因子。

Locklin等［16］研究发觉TGF能够抑制BMSCs的增殖，但能提高其ALP的表达，并能减少和延迟BMSCs向脂肪细胞的转化，Andrades等［17］研究说明，基因重组人转化生长因子β能够诱导BMSCs向成骨细胞分化和成熟。

　　生物力学因素

　　生物力学因素在骨形成进程中的作用亦不容轻忽，它能够阻碍细胞的生长、增殖和分化进程。

Yoshikawa等［18］采纳特制培育皿培育BMSCs，此培育皿能够对细胞产生周期性张力和拉力，同静态培育相较，外力作用下培育细胞的ALP活性、骨钙素水平、DNA含量、细胞干重均明显升高。

　　4骨髓基质干细胞作为基因医治的靶细胞用于骨缺损的修复

　　骨缺损的基因医治是把具有增进成骨作用的基因导入靶细胞，既能诱导其向成骨细胞转化，使之发挥种子细胞的作用，又能在体内骨组织再生进程中持续高效地分泌生长因子，有利于组织工程化骨组织的形成。

骨髓基质干细胞因其容易搜集并进行组织培育，细胞表面有骨诱导蛋白的受体，具有明确的成骨潜能而成为经常使用的靶细胞。

　　Oyama等［19］将TGFβ1基因的复制缺点型病毒转入成骨细胞中，转染后成骨细胞中TGFβ1mRNA的表达仍维持在明显的上调状态，细胞分泌合成的TGFβ1较对照组高46倍，细胞Ⅰ型胶原含量提高了5倍，将转染了TGFβ1的成骨细胞植入体内可明显增加新生骨组织的数量。

金丹等［20］研究说明经hBMP7基因转染的BMSCs增殖能力无明显改变，能够显著提高其合成胶原、ALP、骨钙蛋白、层粘连蛋白的能力，证明经hBMP7基因转染后能够增进BMSCs向成骨细胞转化。

进一步利用经转染的BMSCs修复兔桡骨缺损，经大体观看、X线、组织学检测分析结果证明经转染的BMSCs修复骨缺损的成骨速度和成骨量均优于未转染BMSCs的对照组。

如何操纵外源基因在受体细胞内的表达时刻和表达数量，使之与再生组织的需要相适应，仍需进一步研究。

　　总之，BMSCs是理想的骨组织工程学种子细胞，可是目前只停留在实验室时期，要应用于临床，还有很长的研究道路要走。

且此刻多数研究只是针关于动物，对人的BMSCs特性及培育了解不多。

人的BMSCs培育难度要高于动物，因此，成立一套骨髓基质干细胞提取、培育、分化的标准方式显得加倍必要。

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