铜对土壤功能相对稳定性指数的测量的影响取决于两种酶活性Word文档下载推荐.docx
《铜对土壤功能相对稳定性指数的测量的影响取决于两种酶活性Word文档下载推荐.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《铜对土壤功能相对稳定性指数的测量的影响取决于两种酶活性Word文档下载推荐.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
McGrathetal.2002;
Sauvé
2006）。
许多研究试图评估金属污染物对土壤微生物的影响，通过监视他们活动过程,如酶活性、呼吸、微生物增长率（Dumestreetal。
1999;
Stuczynskietal。
2003;
Effronetal。
2004）。
经常被报道由土壤微生物分泌的酶作为土壤质量指标的发展（Trasar-Cepedaetal.,2000;
Hinojosaetal.,2004;
Sowerbyetal.,2005）。
他们也对小生物土壤质量的变化比其他的更迅速的土壤变量作出回应，可作为早期指标（BandickandDick,1999）。
土壤酶具备这些素质，主要是因为他们在养分循环和生态系统的可持续性（Dick，1997年）发挥中央和关键的作用。
影响酶活性的许多属性，无论是在空间和时间变化的结果都是相当变数的。
因此,几个作者都全神贯注于研究作为土壤健康指标有严重限制的酶的活性。
（e.g.,Bé
caertandDeschê
nes,2006）。
评估污染物对土壤微生物群落的影响越来越有吸引力的方式是利用土壤功能的稳定性的基础上的方法（Bé
功能的稳定性是土壤抵抗力和恢复工作（Pimm,1984）的结合，是土壤生态系统的主要特征。
简单地说，土壤健康已被定义为土壤功能的能力（Karlenetal.,1997）。
因此，如果考虑土壤本身就是一个生态系统，一个健康的土壤必须能够对各种压力表现稳定性。
由于污染土体稳定性的变化可以被认为是一种有害的毒性反应（seeBé
nes,2006forareview）。
在现实中，土壤普遍接受应力来源都是多样化的，如：
自然应力（如干旱，冻结/解冻，火）和人为压力（如有机/金属污染，耕，犁）。
通过相对于在原状土基础上比较它们的性能，得出一个不稳定的土壤的功能的稳定性（OrwinandWardle,2004）。
一些研究应用不同类型的扰动土，然后测定的土壤功能的稳定性的变化（Degensetal.,2001;
Griffithsetal.,2001;
Mulleretal.,2002;
Bé
caertetal.,2006;
Tobor-Kaplonetal.,2006）。
一个土壤功能评价可以使用任何有关土壤生物和生化特性监测。
最近研究2,4—D对土壤功能稳定性的影响（Bé
caertetal.,2006）。
比较受污染和未受污染的土壤样品的酶活动的演变，进行土壤从热应力中对污染物的抵御能力和恢复的影响的评价。
这个工具以一个整体快速评估污染物在土壤中的毒性被开发的，被发现能够有效评价有机污染物。
然而，使用酶的监测是有问题的，因为金属污染的土壤的pH值影响的酶的活性，在测量金属的毒性中。
pH值的双重影响问题尤为重要：
（1）pH值影响酶的底物反应的速率；
（2）影响金属形态。
为了解决第一个问题，缓冲溶液被广泛用于酶活性测定。
允许采取最适pH值的缓冲液测量酶底物反应，方便检测抑制的pH值。
pH值的第二个影响是诸如Cu的金属的形态。
pH值的改变将影响化学平衡，因此以高度可溶以固定或惰性组分比例的形式改变铜在土壤中的形式（Sauvé
2002）。
铜的化学形态很重要，因为它影响土壤酶活性的生物利用度和其内在的对微生物的毒性，而且在土壤中酶的化学相互作用介导的。
在这项研究中，使用β-葡萄糖苷酶酶和蛋白酶活性的稳定性监测作为一个整体测试，使用类似于先前所用的2,4-D的方法（Bé
nes,2006）评估铜污染土壤的生态毒性。
土壤中β-葡萄糖苷酶酶和蛋白酶被选中是因为他们分别是C和N循环中的关键酶。
在土壤中监测β-葡萄糖苷酶酶的活动已广泛应用（见例Aonetal.,2001）,被认为是一个好的土壤质量的指示器（BandickandDick,1999;
KnightandDick,2004;
Gil-Sotresetal.,2005）。
蛋白酶的部分，很少被用作土壤质量指示器。
但是，一个氮矿化的限速酶（delaHorraetal.,2003），在土壤中微量金属元素的影响中以被报告为一个很好的指标（Effronetal.,2004）。
本文的第一个目的是验证使用土壤相对稳定指数评估金属化合物（铜）对土壤酶稳定性的影响。
第二个目的是看看这种方法允许铜对酶活性的影响，可以从理化性质变化的影响（例如，pH值）中脱除，将某种形式的不同研究结果的比较，这可能最终导致选择土壤生态毒理学的工具或健康指标。
2.材料与方法
2.1土壤
所用的土壤（30公斤）是位于ST-安妮贝尔维尤（Montreal,QC,Canada）麦克唐纳校区罗麦吉尔大学实验农场的表层土壤（0-20厘米）。
土壤是通过2毫米的网格筛筛选和在室温和湿度场（2±
1%H2OW/W）的塑料容器中储存。
土壤是含有88％（重量/重量）砂，8％（重量/重量）的淤和4％（w/w的）粘土的壤质砂土。
土壤有机质含量（SOM）是27±
0克有机质每公斤干燥的土壤。
由于在土壤中没有检测到碳酸盐，土壤总有机碳（TOC）是由干式燃烧（LECO,1996）的值是乘以1.724土壤有机碳趋近于土壤有机碳值（NelsonandSommers,1996）。
土壤持水能力（WHC）是37%的水含量（ParentandCaron,1993）和土壤pH值5.6（OrionSureFlowsemi-microRosscombinationpHelectrode）按方法D4972测定（ASTM,1989）。
20种微量元素的ICP扫描（根据SM3120B,Clescerietal.,1998）是用来确保在土壤中的金属污染物的缺失。
根据在魁北克省规定无微量元素的浓度均高于正常的背景水平（EnvironmentQué
bec,1999）：
铜浓度为背景水平与5μgg-1干土。
2.2实验设计
根据因子的实验三个固定因素的迹象（土壤有机质，pH值，铜含量）进行修订的初始土壤（pH值5.6和土壤有机质=1公斤干土有27克有机质）。
设计是由十二个不同的土壤与三个不同内容的修订土壤有机质（27、57和78g有机质每公斤干土）,两个pH（酸性和中性）和两个水平的铜（未被污染的和250毫克公斤1立方米）。
具有相同的土壤有机质和pH值的土壤最终进行分组，同时分析，进行土壤处理。
2.3土壤pH值和有机物质
添加1%的固体碳酸钙使pH值达到中性pH。
对于后者的修正案,样本被分为1公斤（干重）次级样本和放置在2l高密度聚乙烯容器然后处理，均在旋转搅拌器转24h，重组为样本和手动匀浆。
泥炭藓（伯杰泥煤苔有限公司、加拿大魁北克）被添加到初始土壤以达到这三个不同的土壤有机质水平。
由于泥炭藓不能算是一个土壤自带的有机物来源，关于土壤有机质对酶活性的影响不能得出一般性的结论。
事先洗涤泥炭藓，是为了除去过量的盐和腐殖酸，否则可能对土壤的化学和生物反应有过大的影响，如索维中提到的（2002年）。
然后空气干燥并过筛（<
2毫米）。
有机质含量的样品将被称为L,M和H（低=27g有机质每公斤干土、中=57g有机质每公斤干土和高=78g有机质每公斤干土）和pH值将被称为（酸性）和n（中性）。
修定后测量所有土壤最终pH。
土壤酸性，pH值介于4.81±
0.02和5.17±
0.01，而中性土壤处理pH值范围在7.3±
0.01和7.82±
0.01之间。
2.4铜强化
六个土壤处理细分为两组。
一个是使用0.5M钉氯化钙盐溶液来实现250毫克公斤铜（受污染的样品）。
另一个与0.5M氯化钙溶液标准化是为了规范的反离子的存在的Cl-1（未受污染的样品）。
这些水溶性物质的载体为离子水，并用移液管移取（McGrathetal.,2002）。
根据魁北克污染场地适用法规，250mgCukg-1水平是土壤质量标准的B和C之间的中间值。
标准B（100mgkg-1Cu）表示住宅用地可接受的最大允许浓度的铜离子浓度和标准C（500mgkg-1）表示工业用地中最大允许浓度的铜离子浓度（EnvironmentQué
bec,1999）。
将润湿和干燥循环应用在处理污染土壤上是为了模拟铜污染的老化和浸出过量的盐。
随后加入溶液，使土壤在50转旋转搅拌器下搅拌24小时，后放在薄层（＜3cm）玻璃板的润湿和干燥（三个周期）。
使用的早期方法测量每十二最终土壤中的持水量。
每个润湿周期，土壤使用微孔水带来92%的持水能力，然后风干六天。
三次循环后，空气干燥的土壤被过滤，为了模拟微溶性物质经风化、溶解过程释放有毒成分的场景（McLaughlinetal.,2002）。
要做到这一点，土壤需被放置在能让水贯穿且能保留细土颗粒的一端被土工织物膜覆盖的丙烯晴管（17.9厘米直径）中。
然后将试管放在促进沙子渗滤浸出的地方。
微孔水以1:
1的比例增加（w/w）到土壤干重，渗透一夜。
样品进行空气干燥，匀化并在室温下储存至少两个星期后开始分析。
所有样品同时处理，所以存储期间各土壤类型（相同的pH值和土壤中的有机质。
）发生变化。
王水消化后，用电感耦合等离子体原子发射光谱法分析每个样品共可回收铜（总铜）的结果。
未受污染的对照样品（在干燥的土壤的重量为基准）的铜的浓度范围从3.0±
0.25.到8±
0.4mgCukg-1，而污染土壤铜的浓度范围在220±
15和230±
16mgCukg-1之间。
为了微生物适应新环境，土壤应在室温下至少保存一个月的时间。
2.5实验时间
为最终土壤处理准备六个微实验。
该实验是将100克土壤装于1升的玻璃广口瓶中。
在黑暗的在室温下热扰动治疗前后的土壤的持水能力保持在60％。
一半的微实验通过将其加热到60℃并超过17小时被热扰动，模仿热浪或中等强度的火灾（Bé
扰动被应用于受污染和未受污染的缩影。
另一半样品未被扰动。
在热扰动前，提取所有的土壤缩影样本进行化学分析（自由铜，可溶性铜和DOC，详情请参阅化学分析部分）。
缩影实验第1天被热微扰后立即冷却到室温,保持他们的初始含水量。
在同一天，对无扰和热扰动的所有缩影实验潜在的β-葡萄糖苷酶酶和蛋白酶的酶活性进行分析。
2.6稳定性评价
对酶的活动进行监控，每天一次，检测4天。
检测的最终期限是根据皮尔森的相关系数在29715d检测计算选择（Bé
caert,2004）的，根据土壤相对稳定性指标的结果（见土壤相对稳定性指数（RSSI）计算）表明计15天和4天监测周期有好的所有样品和酶试验相关性（皮尔森系数=0.960）。
297个实验的方差分析表明，四天监测方法在土壤污染和清洁方面有着很大的区别，有97%例确定使用15d监测（Bé
caert,2004）。
对不同的土壤和不同的酶的活动进行不同的测定，也包括蛋白酶和β-葡萄糖苷酶。
最后在5天，所有的缩影重复热扰动前的初步化学分析。
2.7酶活性测定
酶活性测定中没有使用pH缓冲液，其他方法一样（LaddandButler,1972;
EivaziandTabatabai,1990）。
这个选择是为了规避使用pH缓冲液会影响评估金属污染对土壤酶活性的影响的问题。
自由Cu2+的活性，表示为PCU2+（通过类比pH，8pCu意味着8-10M的自由Cu2+），在无缓冲液的酶的活性监测过程中监发现毒性存在潜在的变化，证明了我们的选择。
（pCu2+使用水=8.7±
0.06,使用β-葡萄糖苷酶缓冲液=9.33±
0.05和使用蛋白酶缓冲液=12.01±
0.02）。
在1克土壤样品中加入4ml离子水混合后再37℃保存一小时后，再加入1毫升的酶特异性底物溶液，进行β-葡萄糖苷酶的活性的测定（EivaziandTabatabai,1990）。
β-葡萄糖苷酶的底物是对-硝基-苯基-β-D-葡萄糖苷（25毫摩尔）。
通过加入1毫升0.5M的CaCl2和用4毫升的0.5M的NaOH萃取对-硝基苯酚的释放物来终止反应。
对-硝基苯酚被0.45微米聚偏氟乙烯（PVDF）无菌微孔膜过滤回收后在420nm处进行比色测定。
所有数据都重复测量。
用酪蛋白溶液（2%W/V）作为底物进行土壤蛋白酶活性测定（LaddandButler,1972）。
取1克土壤样品在50℃培养2小时。
温育过程中释放的氨基酸被提取出来，向剩余的底物加入三氯乙酸进行沉淀。
芳香族氨基酸与福林酚试剂在碱性溶液中生成蓝色络合物，用比色法在700nm处测定。
2.8化学分析
将40毫升离子水与10克干土置于50毫升离心管中制取水提取物。
对三个重复实验进行多次化学分析。
'
摇晃2小时使土壤悬浮液达到平衡，在11325g离心持续15分钟。
上清液用0.45μm聚偏氟乙烯的微孔膜过滤器过滤。
获得的溶液，分离并化分析自由铜，可溶性铜和溶解的有机碳（DOC）的含量。
首先,用总有机碳燃烧分析仪测量10ml中有机碳的含量（Shimadzu_5000,Kyoto,Japan）。
其次，将15ml的滤液调节至达到0.5mM的Na4EDTA（Sigma,SigmaUltraE5391）溶液，储存于4℃后分析溶解铜含量。
用电感耦合等离子体原子发射光谱法测量。
最后，向15毫升滤液中加入离子强度缓冲（2MKNO3–Fluka,biochemika60414）达到0.01M的KNO3溶液,并立即用铜离子选择性电极分析游离铜活性（pcu2+）（Thermoionplussure-flowcupricOrion9626BN）。
电极用亚氨基二乙酸缓冲校准（Rachouetal.,2007）。
2.9土壤相对稳定指数计算
土壤相对稳定指数是酶促在扰动土壤与无扰土壤间转化的潜在能力的对照（Bé
本研究中使用的土壤相对稳定指数为扰动土壤第1天（扰动后立即）到第4天之间的酶活性（EA）的曲线下的面积的值除以未受扰动的土壤在第1天，第4天酶活性曲线下的面积的值（式
（1）之间）。
土壤相对稳定指数计算使用式
（1）表示热扰动对土壤的能力作用的影响的大小。
更具体地，评估通过一定时间的热扰动后土壤底物转化的量和没有扰动的同一土壤底物的数量。
此外，土壤相对稳定指数是无量纲的，它允许不同土壤之间的比较。
2.10统计分析
所有统计分析是通过使用Statisticav71进行的。
采用最小显著差别检验法对土壤相对稳定指数的结果进行方差分析，因子分析与平均值的比较P＜0.05）。
结果转化成（log（x+1））以遵循试验方差的正态性和同质性的假设。
为了平衡数据集不进行随机蛋白酶的测量。
使用主成成分分析（PCA）法研究土壤相对稳定指数和化学土壤性质之间的关系。
3.结果与讨论
3.1铜污染对酶活性的抑制作用
在未扰动土壤中存在的铜对的酶活性抑制作用如图1。
在土壤中的铜可通过许多途径抑制酶活性：
（i）通过对土壤微生物区系毒性作用减少酶的生产（ⅱ）结合的酶的活性的蛋白质组降低酶的生产，（ⅲ）络合基质（iv）与酶底物复合物反应（Dick,1997）。
为了考虑化学特性和相关毒性变化之间的相互作用，绘制抑制酶的活性与游离铜活性的关系（图1，二次轴）
图1蛋白酶（白色）和β-葡萄糖苷酶（黑色）活性的抑制作用%和自铜活性（pcu2+），酸性土壤和中性土壤样品（正方形），样品（三角形）
从图中可以得出，β-葡萄糖苷酶和蛋白酶两种酶的活性没有关系。
可以推测，其他土壤性质影响酶的活性和更全面的评估是必要的。
这些结果表明，总铜含量或自由Cu2+的活动不能解释酶活性的变化，表明酶的活动和重要的土壤化学性质如pH值和有机质含量之间存在其他重要的关系。
3.2pH值对酶活性的影响
图2：
对b葡糖苷酶和蛋白酶活动和土壤化学性质进行主成分分析（PCA）。
4天内蛋白酶（Prot）和β-葡萄糖苷酶酶（Glu）活性表示为曲线下的面积。
铜是由总铜（TCu）,溶解铜（（DCu）和自由Cu2+（pCu2+）活性表示的。
土壤有机质（SOM）、pH值和溶解有机碳（DOC）也显示出来。
用主成分分析法（PCA）研究化学性质，特别是pH值与这两种酶的活性之间的关系（图2）。
结果表明，总铜或溶解的铜与酶的活动不相关的，但他们与pH值密切相关。
图2还显示，自由Cu2+，pH和酶活性是有相关性的。
然而，pH值对Cu2+和酶活性之间的相关性都有影响。
前三个因素的主成分分析能够解释93.7%的变异。
图2显示了一个投影的变量在阶乘平面（1、2）,它提出了74.5%的总变差。
可以从第一个因素观察到很强的相关性：
pH值（-0.95），有机碳（-0.85），自由Cu2+（-0.87），β-葡萄糖苷酶酶（0.70）和蛋白酶（0.84）。
这是在与已知的pH对酶活性,有机碳和游离态铜的影响是一致的。
此外，据文献8.1（Tabatabai,
1994）得知，在微酸性至中性的土壤pH值范围内，蛋白酶活性与pH值的确是正相关，且是蛋白酶的最适pH值，而β-葡萄糖苷酶，其最适pH值是6.0（EivaziandTabatabai,1990）显示了pH值呈负相关。
总土壤铜（TCu）和溶解铜（DCu）是与第二个因素（分别为0.92和0.90）相关的主要变量,解释27.7%的变异性。
其他所有变量与第二个因素显示弱相关性（<
0.50）。
土壤有机质由于泥煤苔的存在与两个因素的相关性较差（分别为0.05和0.19）。
这些结果证明，被评估的性能都是密切相关的，评价的难点是对土壤质量的评估。
土壤性质是相互依存的。
研究结果还表明，pH值对酶活性有较强的影响。
这可以通过酶底物反应率对pH值有高依赖性来解释。
在文献中，缓冲区的使用已被吹捧为手段，以确保不同的土壤pH值的样本，或不同的研究结果之间可比性。
但是，当使用缓冲液评估酶活性时，如果缓冲区的pH值与土壤的是不同的，不仅改变了金属污染物的物种形成，而且化学物质构成的缓冲也可以作为配体反应，减少铜物种的生物有效性。
此外，pH值对铜物种形成（见Sauvé
2002），配体络合作用的程度（WuertzandMergeay,1997）和溶解有机碳（MesquitaandCarranca,2005）的影响是众所周知的。
毫不奇怪的是，结果显示，CU2+与溶解有机碳含量和pH值密切相关。
铜作为配位剂对有机物质有很强的亲和力（MesquitaandCarranca,2005）。
因此，后者也可影响铜的形态，从而改变酶的抑制作用。
在全球范围内,酶活性的评估对土壤性质有强烈的依赖性,特别是pH值,人为来源（铜）引起检测的变化几乎是不可能的。
与之前的硝化试验一致，比污染物水平更依赖土壤理化性质，如pH值（Sauvé
etal.,1999;
Smoldersetal.,2001）。
物理，化学和生物之间的特性都是相互联系的，一个属性的变化可能会引起许多属性的变化。
关于pH值的依赖性不使用缓冲产生相关的其他问题，需要在某种程度上被认真考虑否则这研究的结果的使用将受到限制。
3.3酶活性：
热扰动对干净和受污染的土壤的影响
图3举例说明扰动/无扰动的和受污染/未被污染的土壤中Ha和HNb葡萄糖苷酶（分别为3A和3C）和蛋白酶（分别为3B和3D）的酶的活性随着时间的推移演变的情况。
β-葡萄糖苷酶酶和蛋白酶活性对热扰动（17小时，60℃）表现出不同的反应。
由于酶的活性与土壤微生物的多个进程有着密切的关系，它的测量可以提供土壤的生物和物理化学条件的综合信息（Aonetal.,2001）。
在全球范围内，为可以在所有的样品中观察到酶活性的日变化。
有趣的是，在具有相同的特征的扰动和未扰动土壤中观察到的β-葡萄糖苷酶酶活性的变化模式（图3A和C）是相似的。
这似乎表明，尽管每天的变化，变化的原因是在类似的方式影响样品，，因此当与扰动的样品相比时也可以考虑自然变异。
更具体地，是通过比较加热的土壤与相应的未加热土壤中pH对土壤酶活性的测量的影响得知不使用缓冲液是可以的。
图3酶活性反应的热扰动的应用。
Ha（A和B）和Hb（C和D）酶活性的曲线。
A和C显示β-葡萄糖苷酶酶在4天监测周期内的变化而B和D监测代表相同土壤的蛋白酶在监测周期内的变化。
△的符号代表未受污染的土壤样品，◆代表污染土壤样品，平线代表无扰样品，而虚线代表扰动的样品。
误差条代表六个重复样品的标准偏差。
在未受污染的土壤的β-葡萄糖苷酶酶活性受到热扰动的影响强烈，第一天下降到约50%相对于未扰动土样，在四天的监测期内一直保持。
这种现象在污染土壤也被观察到。
热扰动未受污染的土壤的蛋白酶活性，尽管在第一天强活性降低（扰动后立即显示），但是第二天有着显著的刺激并在随后几天一直维持一个较高的活动水平。
这一观察对于中性土壤更为明显（图3d），刺激可高达无扰的土壤活性的2.5倍。
因为蛋白酶是细胞内主要的酶（Dick,1997），这种刺激可以归因于热扰动后微生
升级会员 