第二章 酶与细胞的固定化Word格式.docx

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（2）考察固定化酶稳定性

（3）考察固定化酶最适反应条件

二、酶的固定化方法

（一）吸附法

吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。

酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。

吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。

（1）物理吸附法

物理吸附法（physicaladsorption）是通过物理方法将酶直接吸附在水

不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。

是制备固定化酶最早采用的方

法，如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此法进行固定化。

常用载体：

⏹无机载体：

氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。

一般吸附量<

1mg蛋白/克吸附剂

⏹有机载体：

淀粉、白蛋白等。

一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂

⏹研究热点：

大孔型合成树脂、陶瓷

物理吸附法制备固定化酶，操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后，活性部位及空间构象变化不大，故所制得的固定化酶活力较高。

靠物理吸附作用，酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，所以使用受到限制。

常与交联法结合使用。

（2）离子吸附法

离子吸附法（ionadsorption）是将酶与含有离子交换基团的水不溶性

载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结

合的固定化方法。

此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等，

在工业上用途较广。

DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：

将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNa0H和水洗涤

加入pH7.0-7.5的米曲霉3042粗酶液

（水解乙酰-DL-Ala活力为25umol/ml·

h）

充分混合，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液

（1g湿重载体加60ml酶液）

固定化酶活力回收50-60％

用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。

水解乙酰-DL-A1a活力为600-800umol/g·

h湿固定化酶。

⏹离子吸附法所使用的载体是某些离子交换剂。

阴离子交换剂有DEAE-纤维素、四乙氨基乙基（TEAE）-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；

阳离子交换剂有羧甲基纤维素、纤维素柠檬酸盐等。

其吸附容量一般大于物理吸附剂。

⏹离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。

此外，吸附过程同时可以纯化酶。

⏹吸附力弱，不适宜的pH，高盐浓度，高底物浓度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。

提高吸附容量和吸附力的途径：

1选择最佳条件操作（如温度、pH）。

2选吸附量大的载体，控制酶和载体量。

3采用高酶量吸附。

4开发新载体。

5对酶进行修饰后再进行交换吸附。

如烃基-琼脂糖衍生物吸附酸性pH的酶（脲酶），用亲和吸附剂ConA-葡聚糖能专一吸附糖蛋白。

对酶进行修饰以后再与载体结合，胰蛋白酶+丙烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联再加DEAE-纤维素结合。

结果：

结合力增大（吸附量也大），也相当稳定，使用寿命长，有时可以连续使用3个星期。

多孔物质包络法：

利用棉布、尼龙布、金属死网、海绵、塑料等固定化放线菌、真菌组成盘状生物

反应器，进行连续生产有机酸、糖化酶、四环素。

这些材料有足够大，但空隙又不

十分大的空隙，能够使细胞进入空隙，通常为细胞直径的见倍大。

超过滤法：

利用超过滤膜将细胞固定化。

底物和产物可以自由进出超过滤膜，而膜内的细胞

却出不来。

制备成膜反应器和生物传感器。

但是需要防止细胞生长导致浓度过高而

使超过滤膜破裂。

吸附方法：

1、静态吸附，自然吸附、解吸、再吸附的固定化方法。

效率低，时间比较长，而且不完全。

2、电沉积，在载体附近加电极，酶移向载体表面的固定化方法。

需要酶在电场中不破坏，保持原来酶性能。

3、动力法固定化，酶与载体混合后搅拌等条件下进行固定化，注意速度，不破坏酶和载体。

4、反应器固定化，载体装入反应器，再循环加入酶溶液达到固定化。

但是吸附少，不适合的条件（pH、盐等）容易解吸。

注意操作条件。

最主要，更加有效的还是开发新的吸附剂。

影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:

1.pH：

影响载体和酶的电荷变化，从而影响酶吸附。

2.离子强度：

多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。

3.蛋白质浓度：

若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。

4.温度：

蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。

5.吸附速度：

蛋白质在固体载体上吸附速度比小分子慢得多。

6.载体：

对于非多孔性载体，颗粒越小吸附力越强。

多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。

吸附法的优点：

操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。

吸附法的缺点：

酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。

（二）包埋法（entrappingmethod）

将聚合物单体和酶溶液混合后，再用聚合促进剂（包括交联剂）的作用而聚合，酶就包埋在载体中达到固定化。

酶本身不参与反应，所以较安全。

但在聚合过程中有自由基产生及聚合时放出热，酶与试剂间可能发生化学反应，这些因素可能会使酶失效，或者降低酶活性。

操作时注意条件的控制。

（1）凝胶包埋法

凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉

胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。

聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法：

先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。

它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。

聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。

聚丙烯酰胺凝胶包埋法：

1ml溶于适当缓冲液的酶溶液

加750mg丙烯酰胺（单体）和40mgN，N’-甲叉双丙烯酰胺

（交联剂）的3ml溶液

加0.5ml15％的二甲氨基丙腈（加速剂），加入1％过硫酸钾（引发剂）

混合，于25℃保温10min，

含酶凝胶

将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒于低温储存或冷冻干燥

为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相（一种乳化剂，与水相有相同密度）的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。

卡拉胶包埋法

卡拉胶是由角叉菜（鹿角菜）中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。

具体方法：

将100g酶在37-50℃溶于水中，又将1.7g卡拉胶在40-60℃溶于34ml生理盐水中，二者混合后冷却到10℃，所成凝胶浸在0.3mol/LKCl溶液中硬化，作成适当大小的颗粒，即为固定化酶。

（2）微胶囊包埋法

微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。

它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。

常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。

用微胶囊包埋法制得的微囊型固定化酶的直径通常为几微米到数百微米，胶囊孔径为几埃至数百埃，适合于小分子为底物和产物的酶的固定化。

如脲酶、天冬酰胺酶（治疗白血病）、尿酸酶、过氧化氢酶等。

方法有界面聚合法、界面沉淀法等。

微囊制备方法：

界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。

如含有高浓度血红蛋白的酶溶液在与水不互溶、沸点比水低的有机相中乳化，加入油溶性表面活性剂，形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在搅拌下加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油-水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，从而制成固定化酶。

作为高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。

含酶的10％血红蛋白水溶液与己甲叉二胺的水溶液混合

立即在1％Span85的氯仿-环已烷中分散乳化

加入癸二酰氯（有机相）后，便在油-水界面发生聚合反应

弃除上清液，加入Tween-20去乳化

洗除有机溶剂，除去未聚合单体后

转入水相制得固定化酶

界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。

此法曾用来制备Asn酶、脲酶等。

制备方法一般是：

将酶水溶液与亲水单体（如乙二醇）用一种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一有机溶剂疏水单体（如多异氰酸）溶液在搅拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合化，这样水相中酶便包埋在聚合体（聚脲）膜内。

尼龙膜界面聚合包埋

（酶+己二胺水溶液）+庚二酰氯有机溶剂

混合 

乳化，二种单体（己二胺和庚二酰氯）在水相、有机相交界处聚合

形成包埋酶的尼龙膜珠粒

Tween20破乳化，得到微囊包埋酶

（三）共价键结合法

通过载体的功能基团与酶侧链基团上非必需基团共价结合，制备成的固体酶的方法。

优点：

应用最广，固定化结合牢、稳定而酶不丢失，可以连续使用。

共价键结合法

可以形成共价键的基团：

游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，

酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键

常用载体：

天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体

1、载体要求：

亲水载体优于疏水载体（酶蛋白结合量，固定化后酶活性，稳定性方面都比较好），而且亲水基存在可以减少疏水基的有害影响。

载体特点：

1结构疏松2表面积大3机械强度大

4带有在温和条件下可与酶侧链基团共价偶联的功能基团

5没有或很少有非专一性吸附6载体来源容易，并能反复使用。

一般与亲和层析所需载体的要求、标准一致

如:

天然纤维素或衍生物；

葡聚糖凝胶；

琼脂糖亲和性好，机械性能差

合成的：

聚丙烯酰胺；

多聚氨基酸；

聚苯乙烯，尼龙机械性能好，但有疏水结构

2、偶联方法：

偶联成功与否取决于：

载体：

功能基团，芳香氨基，羧基，羧甲基等

酶分子：

侧链非必需基团

（游离的α--氨基，lys-ζ-NH2，Arg-胍基，C-COOH，Asp-γ-羧基，Glu-羧基，酚羧基，巯基，咪唑基）

载体、酶分子上的基团不会直接反应，其功能基团要活化。

在实际中偶联最普遍的基团是：

氨基、羧基以及苯环。

被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性。

3、载体活化的方法

重氮法；

异硫氰酸反应；

溴化氰-亚氨碳酸基反应；

芳香烃化反应；

叠氮

法；

酰氯酰化反应；

酸酐反应；

缩合反应；

巯基--二硫基交换反应；

金

属偶联反应

重氮法

重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方

法，是共价键法中使用最多的一种。

常用的载体有多糖类的芳香族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生

物等。

芳香氨基载体方法特点：

载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，再在温和条件下和酶分子上相应基团直

接偶联。

芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入蛋白质分子中Tyr等集中的疏水区并偶联

化而导致失效。

a当载体为电中性或疏水性时，这种倾向性越大。

b当载体用亲水极性物质时，这种疏水区的特性就大大减小了。

如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶固定化，偶联到重氮化的电中性载体如对氨基苄基纤维素时，产生固定化酶无活性。

偶联到重氮化的苯胺-多孔玻璃时，得到固化酶都具很高酶活性。

异硫氰酸反应

含芳香氨基的载体先用硫芥子（或者光气）处理成异硫氰酸盐的衍生物，这

种产物在温和条件下，优先与酶分子的氨基反应，在中性pH下优先与α-氨基反应，

可达到选择性偶联的目的。

溴化氰-亚氨碳酸基反应

带羟基的载体纤维素、葡聚糖、琼脂糖等是最常用的载体。

在碱性条件下，载体的OH基和溴化氰反应，生成活泼的亚氨碳酸基，在弱碱中直接和酶的氨基进行共价偶联。

芳香烃化反应

含羟基的载体在碱性条件下，和三氯三嗪等反应，引入卤素基后直接与酶的氨基、酚羟基或者巯基等偶联。

叠氮法

载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。

含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。

如CM-sephadex（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶，其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。

酰氯酰化反应

含羧基载体（如羧酸树脂）通过氯化亚砜处理成活泼的酰氯衍生物，再与酶偶联。

酸酐反应

乙烯等和顺丁烯二酸酐的共聚物，通过其活泼酸酐基直接与酶氨基偶联。

生成

的固定化酶一般有比较高的活力。

缩合反应

利用羰二亚胺的活化作用，使氨基、羧基直接偶联，缩合为肽键的反应。

载体成

为活泼的酰基异胍衍生物。

带羧基载体与环二已基二亚胺（DCCI）存在时，用N-羟基琥珀酰亚胺活化，在

温和条件下和酶的氨基反应，缩合反应控制pH≈6，反应限于氨基。

巯基--二硫基交换反应

巯基或二硫基载体通过巯基--二硫基交换反应和酶分子上的非必需巯基偶联，

当功能基团为巯基，先用2，2-吡啶二硫化物处理，变成二硫基，生成的中间产物在

酸性条件下与酶的巯基发生交换达到偶联。

化合物在酸性条件下发生交换。

在大量

巯基化合物存在条件下逆转为载体和巯基酶。

金属偶联反应

一些过渡态金属能使纤维素、尼龙、滤纸、酵母细胞等直接转化成固定化的载体。

方法：

将上面这些材料浸入金属溶液中，过滤、洗涤后加酶而成。

常用金属有钛、

锡、锌、铁等氯化物，其机制目前还不清楚。

偶联反应中的保护措施：

1、采用适宜的固定化材料和方法。

如重氮化注意载体的亲水性和疏水性。

2、严格控制反应条件，提高反应专一性。

如与α-氨基反应，保护其他氨基。

3、用抑制剂或者底物保护酶活性中心和必需基团避免影响酶的活性构型和相应基团。

酶的偶联量:

单位载体上偶联酶的总量与“相对酶活力”之间的平衡。

相对酶活力：

指固定化酶和相等蛋白量的原酶的活力比。

由于固定化时，受到载体、方法、条件、酶反应系统的影响，即使以上因素一定，还会受到酶偶联量的影响。

1、只有达到一定的偶联量，酶活性达到最高。

2、超过一定的偶联量，酶过多集中于载体的局部，造成空间位阻效应，部分酶无法表现活性。

随酶偶联量上升酶活性反而下降。

寻找二者平衡点关系，才能使酶活性达到最高。

共价偶联法中的几个影响因素

（1）载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具

备在温和条件下与酶结合的功能基团。

（2）偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。

（3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。

（4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。

共价偶联法的优点、缺点

（1）共价偶联法的优点：

得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用。

（2）共价偶联法的缺点：

载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制

条件才可以获得较高活力的固定化酶。

同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。

（四）交联法

交联法（cross-linking）是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。

由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。

⏹交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋

白间或酶分子与载体间进行交联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。

⏹能起交联作用的试剂很多，但目前常用的交联试剂是戊二醛和双

耦联苯胺-2,2’-二磺酸。

交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合于载体上。

戊二醛属于同型，还有异型：

甲苯-2-异氰-4-异硫氰；

交联可以在分子内，也可

以在酶分子之间。

这是与酶量有关的一个问题。

酶浓度低时，交联发生在分子内，酶浓度高时，

交联发生在分子间，

固定化后，酶与载体成为不溶态的颗粒。

缺点：

固定化后，往往颗粒小，机械性能差。

酶直接交联法

在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。

固定化依赖酶与试剂

的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。

酶辅助蛋白交联

当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。

这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。

吸附交联法

先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂

上，再用戊二醛等双功能试剂交联。

用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。

交联包埋法

把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。

这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。

实验方法上的要点：

1）交联条件激烈，需要保护性措施。

2）交联剂的链长和功能基团的选择问题。

只要选择适当，有利于建立某些分子内交联，亚基固定和四级结构维持，增加酶的稳定性。

但链过长，疏水性上升，疏水性升高，对固定化酶有害。

各类固定化方法的特点比较：

比较项目

结合法

吸附法

包埋法

共价键结合

物理吸附

离子吸附

制备难易

难　

易

易

较难

固定化程度

强　

弱

中等

强

活力回收率

低　

较高

高

中等

高

载体再生

不可能　

可能

可能

不可能

费用

高　

低

低

底物专一性

可变　

不变

不变

可变

适用性

较广

酶源多

广泛

小分子底物、药用酶

第三节固定化酶的性质及其影响因素

一、影响固定化酶性质的因素

1、酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。

2、载体的影响

3、固定化方法的影响

固定化对酶活性和酶反应体系的影响是十分复杂的，常因酶的种类、反应系统的组成，特别是固定的方法及载体而显著不同。

为了简化，通常作两个假设：

（1）酶在载体表面或多孔介质内的分布是完全均匀的。

（2）整个系统各方同性。

在上述条件下，固定化对反应体系的影响，可以概括为三种类型。

构象改变和屏蔽效应

构象改变是指：

酶在固定化的过程中，出于酶与载体相互作用使酶的活性中心或变构中心的构象发生变化从而导致酶活性下降。

这种效应难以定量描写也难以预测。

通常出现在吸附法和共价键结合法。

立体屏蔽效应是：

由于载体对酶的活性中心或变构中心造成空间障碍，因而底物或效应物与酶无法接触，从而影酶的活性。

若在酶和载体间加入臂，可以得到改善。

微环境的影响

微环境是紧邻固定化酶的环境区域。

微环境的影响是由于载体的亲水与疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化效应，或者是酶对效应物作出反应的能力的一种效应，通常可以通过改变载体和介质的性质作出判断和调节。

分配效应与扩散效应

分配效应是由于载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物或其他效应物在微观环境和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响了反应速度。

作为一般规律是：

（1）如果载体与底物带有相同电荷，则酶的Km值将因固定化而增大；

如果带有相反电荷则相反。

（2）当载体带正电荷时，固定化之后，酶活性-pH曲线向酸性方向偏移；

相反，阴离子载体将导致该曲线向碱性方向偏移。

（3）以上效应可通过提高介质离子强度而削弱或消除。

（4）采用疏水载体时，如底物为极性物质，或电荷物质，则酶的Km值将因固定化而降低，其他效应物亦然。

扩散限制效应是指：

底物或其他效应物的迁移和运转受到限制的一种效应。

它分内扩散效应和外扩散效应两种。

外扩散限制，是指上述物质从宏观体系穿过包围在固定化酶周围近乎停滞的液膜层到固定化酶表面所受到的限制。

可以充分搅拌或混合而减小或消除。

内扩散限制，是指上述物质从固定化颗粒表面来到颗粒内部酶活性位点受到的一种限制。

一般规律：

1）其效应对反应速度的影响取决于这个效应本身的大小，也取决于它与酶固有速度的相对大小；

酶反应速度原来小，扩散限制影响也小；

酶反应速度原来大，扩散限制影响也大。

2）外扩散可以通过搅拌与混合，减轻或者消除。

二、固定化后酶性质的变化

1、固定化对酶活性的影响：

多数情况下酶活性下降，反应速度下降

①酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；

②当酶与载体结合时，它的高级结构发生了变化，其构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；

③酶被固定化后虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻的影响。

也有在个别情况下，酶经固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。

2、固定化对酶稳定性的影响

（1）操作稳定性提高

（2）贮存稳定性比游离酶大多数提高

（3）对热稳定性，大多数升高，有些反而降低

（4）对分解酶的稳定性提高（5）对变性剂的耐受力