流行性脑脊髓膜炎诊断标准及处理原则中国疾病预防控制中心Word文档下载推荐.docx

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3.2.4皮肤、粘膜瘀点典型或融合成瘀斑，血压明显下降、脉搏细速、脉压差缩小。

3.2.5颈项强直、角弓反张、克氏征和布氏征阳性。

3.2.6瞳孔大小不等、边缘不整、对光反应迟钝、眼球常凝视。

3.2.7呼吸快慢及深浅不均或呼吸暂停。

3.2.8幼儿发病多不典型，常见高热、呕吐、嗜睡外，还多见极度不安与惊厥、拒乳、尖叫、腹泻、咳嗽、双目凝视、颈项强直和布氏征阳性，其他脑膜刺激征可能缺项。

前囟未闭者多见隆起，呕吐频繁而失水者也可出现囟门下陷。

3.3实验室诊断

3.3.1血象：

白细胞数显著增高，最高可达40×

10（上标始）9（上标终）/L，中性粒细胞在80％～90％以上。

3.3.2疑为流脑者应做腰椎穿刺检查，脑脊液（CSF）压力常增高达1.96kPa以上；

典型病例CSF的外观混浊如米汤样甚或脓样；

白细胞数增多，可达每升数亿，以多形核细胞为主；

蛋白质显著增高，可达1～5g/L；

糖量常低于2.22mmol/L，氯化物也稍降低。

CSF涂片可在中性粒细胞内找到革兰氏阴性双球菌。

3.3.3从病人CSF或急性期血液分离到Nm，见附录A（标准的附录）。

3.3.4从病人急性期血清或尿或CSF中检测到Nm群特异性多糖抗原，见附录C（标准的附录）。

3.3.5检测病人恢复期血清抗体效价较急性期呈4倍或4倍以上升高，见附录B（标准的附录）。

3.3.6以PCR检测到病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，见附录D（提示的附录）。

3.4病例分类

3.4.1疑似病例：

3.1加3.2.1或3.2.2或3.2.3之一项。

3.4.2临床确诊病例：

疑似病例加3.2.4或3.2.5或3.2.6或3.2.7之一项。

3.4.3确诊病例：

疑似病例或临床确诊病例加3.3.3或3.3.4或3.3.5或3.3.6之一项。

4处理原则

4.1对病人早期处理，见附录E（提示的附录）。

4.1.1发现疫情及时向卫生防疫部门报告。

4.1.2就地隔离，抢救治疗，降低病死率。

4.1.3给予抗菌药物，及时控制感染。

4.1.4早期发现并及时纠正休克与弥漫性血管内凝血（DIC）。

4.1.5若早期发现颅内压增高症状，及时应用脱水疗法防治脑疝和呼吸衰竭。

4.2对易感人群的处理，见附录F（提示的附录）。

4.2.1与患者密切接触的人群出现上呼吸道感染样病人，应按轻症流脑患者处理。

4.2.2根据流行病学监测结果，制定A群脑膜炎双球菌多糖菌苗预防注射的计划，在流行前期完成接种任务，免疫对象接种率应达到90％以上。

4.2.3除了完成上述菌苗常规免疫任务以外，还应备有应急接种用的A群脑膜炎双球菌多糖菌苗，用于控制流脑暴发流行。

4.2.4在未免疫地区出现A群Nm引起流脑暴发流行时，除了对15岁以下儿童，还应酌情对与病人密切接触的成人应急接种上述菌苗。

4.2.5目前在我国，若出现非A群Nm引起流脑局部暴发，应及时对病人全家以及与其毗连的邻居实施抗菌药物预防。

附录A

（标准的附录）

流脑病原学诊断方法

A1病原体（脑膜炎奈瑟氏菌Neissriameningitidis）分离

从疑似流脑患者采集CSF或急性期血液分离Nm。

A1.1标本的采集

A1.1.1CSF：

无菌操作，吸出CSF2mL，立即放到无菌试管内离心（2000～3000r/min，30min），用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到10％羊血巧克力色琼脂上（CSF上清液部分供检测Nm特异抗原，亦可将其置于－20℃待测），5％二氧化碳环境37℃培养24～72h，每日检查细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。

A1.1.2血液：

采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入4mL血液（余下的2mL血液同上离心后吸出血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其置于一20℃待测），同上述条件培养24～72h，每日进行分离培养。

A1.2接种和菌种鉴定

A1.2.1细菌形态：

Nm应为革兰氏阴性，呈卵圆形或肾形，0.8μm×

0.6μm大小。

常成对排列，临近两边扁平凹陷。

A1.2.2菌落：

Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5％二氧化碳，37℃培养24h后，其菌落直径约1mm，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。

培养时间延长，菌落增大、变成黄色、不透明，并可出现颗粒状中心和放射性周边。

A1.2.3生长及抗原特性：

绝大多数Nm菌株分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。

不分解蔗糖、果糖和乳糖。

过氧化酶和氧化酶阳性。

Nm新分离菌株具有下列主要抗原：

血清群特异性荚膜多糖，主要外膜蛋白－OMP（包括血清型特异的2/3类OMP，亚型特异的1类OMP以及4与5类OMP），铁调节蛋白，脂寡糖（LOS），H.8脂蛋白，还有菌毛抗原等，根据群特异性荚膜多糖的结构与组成成分，Nm可分为13个血清群（A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y、Z），其中90％以上的病例是由A、B和C群Nm引起的。

根据2/3类OMP可将B群与C群Nm分成20个血清型，但差不多半数菌株目前尚不能分型。

在可分型菌株中，以15、2和4型，P1.2、P1.1、P1.12、P1.15及P1.16亚型多见；

对于A群Nm现有4与21两个血清型，以P1.7与P1.9亚型多见。

Nm还可以分成13个LOS免疫型，其中A群以L10和L11型多见，B群中以L3，7，9复合型多见。

Nm群特异性荚膜多糖、型和亚型的OMP及LOS等抗原成分对流脑发病与流行及其菌苗的研究均具有重要价值。

附录B

流脑血清学诊断方法

B1玻片凝集试验

B1.1目的

应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。

B1.2材料

B1.2.1待检的Nm菌株纯培养物。

B1.2.2Nm诊断血清：

多价I（包含A、B、C、D群），多价Ⅱ〔包含1889（Y）、1890（H）、1892（29E）］，多价Ⅲ［包含319（W135）、1916（X）、1486（I）、1811（K）群］及各群单价血清，共计14种。

B1.2.3洁净载玻片。

B1.2.4生理盐水。

B1.3试验方法

B1.3.1先将诊断血清按说明书稀释成所需的浓度，滴一滴在洁净的玻片上。

B1.3.2用白金耳刮取菌苔少许，在玻片上沾取少量血清，在一旁研磨均匀，再与血清混匀。

B1.3.3轻轻摇动玻片数次，在1～2min内出现明显凝集者，即为阳性。

B1.3.4检查从病人分离的疑似Nm时，先试A群血清，若不与其发生凝集，则试用B或C群血清，仍不凝集时，则试用多价Ⅱ或多价Ⅲ血清。

若发生凝集，再用单价血清定群。

从病人分离的疑似Nm对现有诊断血清皆不凝集者则送研究单位进一步鉴定。

B1.3.5在玻片上与各群诊断血清、盐水或正常兔血清皆发生凝集者，即定为自凝菌。

B2酶联免疫吸附试验（ELISA）

B2.1目的应用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中的抗体水平。

此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。

B2.2材料

B2.2.1酶联免疫吸附试验检测仪。

B2.2.2聚苯乙烯板（40孔或96孔）。

B2.2.3加样器（单头或4头或8头，定量为0～200μL）。

B2.2.4羊抗人IgG辣根过氧化酶结合物。

B2.2.5试验质控血清（抗体阳性和阴性的人血清）。

B2.2.6菌体抗原（A、B和C群Nm标准菌株）或A群Nm多糖菌苗。

B2.2.7包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液）：

碳酸氢钠（NaHCO（下标始）3（下标终））　　　　　　　　2.9g

碳酸钠（Na（下标始）2（下标终）CO（下标始）3（下标终））　　　　　　　　　1.6g

叠氮钠（NaN（下标始）3（下标终））　　　　　　　　　　0.2g

加蒸馏水至1000mL，pH9.6，置4℃可备用两周。

B2.2.8洗涤液（0.5mol/L氯化钠）：

氯化钠（NaCl）　　　29.3g

吐温－20（Tween－20）0.5mL

加蒸馏水至1000mL，临用前配制。

B2.2.9稀释液：

氯化钠（NaCl）8.0g

磷酸二氢钾（KH（下标始）2（下标终）PO（下标始）4（下标终））　　　　　　　　　　　　　　0.2g

磷酸氢二钠（Na（下标始）2（下标终）HPO（下标始）4（下标终）·

12H（下标始）2（下标终）O）　　　　　　　　　　2.9g

氯化钾（KCl）0.2g

加蒸馏水至1000mL，pH7.4，置4℃备用。

B2.2.10底物缓冲液：

（1）0.2mo1/L磷酸氢二钠

12H（下标始）2（下标终）O）35.8g

蒸馏水500mL

（2）0.1mol/L柠檬酸

柠檬酸〔C（下标始）3（下标终）H（下标始）4（下标终）（OH）（COOH）（下标始）3（下标终）·

H（下标始）2（下标终）O］10.5g

（1）液和

（2）液分别置4℃备用。

临用前按下述配方配制底物溶液，pH为5.0：

（1）液2.57mL

（2）液2.43mL

邻苯二胺4mg

蒸馏水5mL

30％H（下标始）2（下标终）O（下标始）2（下标终）　　　15μL

B2.2.11填充液：

稀释液　　　　　　　　　　　　　100mL

白明胶或牛血清白蛋白（BovineSeriumAlbumin，BSA）0.5g

B2.2.12终止溶液：

2mo1/L硫酸（H（下标始）2（下标终）SO（下标始）4（下标终））。

B2.3试验步骤

B2.3.1包被抗原的制备

将Nm纯培养的菌苔刮到生理盐水中，离心（3000r/min，30min）洗涤菌体3次，再混悬于生理盐水中，置56℃30min灭活，用比浊法测定菌悬液中细菌浓度，用包被液将其稀释成10（上标始）6（上标终）个菌/mL作为包被抗原。

对于A群Nm，亦可将A群Nm多糖菌苗稀释到10μg/mL进行包被。

B2.3.2抗原的包被

用蒸馏水把酶标板各孔冲洗干净，空干水，置37℃烘干；

往每孔中加包被抗原100μL，置4C过夜；

倾出孔内液体，用洗涤液冲洗各孔3次，每次1min，并且均在干净的吸水纸上或纱布上拍打酶标板，空干孔内的液体。

B2.3.3填充

空干孔中液体，用1mL吸管加填充液，每孔加以0.25mL；

置室温30min，同上洗涤，空干孔内液体；

酶标板置塑料袋中，密封贮存于4C，可备用一个月。

B2.3.4检测待检血清

B2.3.4.1病人急性期和恢复期血清均从此1∶2开始，用稀释液连续倍比稀释到第7孔，第8孔以稀释液代替血清作为阴性对照之一；

酶标板置37℃培育1h后同上洗涤。

B2.3.4.2加酶结合物

上述酶结合物用稀释液稀释到预试测定的最适工作浓度，每孔加100μL，置37C反应1h后同上洗涤酶标板。

B2.3.4.3每孔加B2.2.10中配制的底物溶液100μL，置37℃反应15min。

B2.3.4.4终止反应

每孔加2mol/L硫酸（H（下标始）2（下标终）SO（下标始）4（下标终））50μL。

B2.3.4.5测光密度值

在495nm波长下测定每孔的光密度值，并记录。

B2.3.4.6每次实验设置下列对照：

阳性和阴性血清质控对照；

抗原对照（以稀释液代替待检血清，其余同试验组）；

缓冲液对照（以包被液和稀释液代替抗原和待检血清，其余同试验组）。

B2.3.4.7结果判定

若被检孔的光密度值与平行对照孔的光密度值比值（P/N）≥2，即判断为阳性反应。

B3杀菌力试验

B3.1目的

应用微量杀菌力试验（TTC法）测定病人急性期和恢复期血清中对Nm的杀菌抗体水平。

此方法也可用于健康人群的血清抗体测定。

B3.2材料

B3.2.1靶菌：

对补体的自然杀菌作用具有耐受性，但对杀菌抗体反应敏感的Nm（A群29019，B群和C群Nm）。

B3.2.2稀释液：

Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水

A液：

氯化钠（NaCl）8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，磷酸氢二钠（Na（下标始）2（下标终）HPO（下标始）4（下标终））1.15g，磷酸二氢钾（KH（下标始）2（下标终）PO（下标始）4（下标终））0.2g，蒸馏水800mL；

B液：

氯化钙（CaCl（下标始）2（下标终））0.1g，蒸馏水100mL；

C液：

氯化镁（MgCl（下标始）2（下标终）·

6H（下标始）2（下标终）O）0.1g，蒸馏水100mL。

上述三液分别灭菌121℃，15min，置4℃备用。

需用时按A液8份，B液和C液各1份的比例混合，pH为7.1。

使用时每100mL稀释液加灭活小兔血清1mL，万古霉素500μg，多粘菌素B2500单位或硫酸抗敌霉素5000单位。

配就的稀释液盛于小瓶中，置4℃备用2周。

B3.2.3滴定板：

底部呈“U”形的96孔有机玻璃微滴板，并备用同样大小的普通玻璃作盖板。

将它们平放在80℃的烤箱内烤2h后备用。

试验完毕，以约80℃的热水泡板1h杀死靶菌，再以自来水冲洗干净，并用棉棒拭净不洁净的孔。

最后以蒸馏水冲洗一次，37℃烤干后同上于80℃干烤。

滴定板使用一段时间后或遇到杂菌污染较严重时，可用热水杀死靶菌并冲洗干净；

在比较稀的硫酸重铬酸钾清洁液内浸泡4h，冲洗干净后同上处理备用。

B3.2.4兔补体

B3.2.4.1补体可从幼龄兔或成龄兔血清中筛选，预试测定要求它们既不能具有自然杀靶菌的活性，但加有已知阳性参考血清时应产生较高杀菌抗体滴度。

不过，幼龄兔被选中的机率较高。

B3.2.4.2将所选家兔从颈动脉放血或抽取全部心血，置4℃，待血液凝固后尽早分离血清，混合后，分装到2mL安瓿中，每只放1mL血清。

立即将安瓿置—20℃以下冰箱内冷冻过夜，次日进行冷冻干燥。

冻干以后再抽样检查时，不应出现非特异杀菌反应，特异杀菌抗体滴度在1：

3200以上则保存在—20℃以下冰箱内，可备用3～6个月。

为减少补体批次间的差异，可将所选定的兔血清混合后进行冷冻干燥，再作质量检定，合格者则保存于—20℃以下。

B3.2.5氯化三苯四氮唑（TriphenylTetrazoliumChloride，TTC）琼脂培养基（TTC琼脂）

B3.2.5.1TTC琼脂配方：

牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，日本多胨3.0％，可溶性淀粉0.2％，以蒸馏水配制，调pH7.4～7.6，琼脂0.5％。

B3.2.5.2TTC琼脂制作

上述培养基成分熔化后，按每10mL或20mL分装于大试管，121℃灭菌15min，冷却后置4℃备用。

临用前将培养基加热熔化，每10mL培养基加50％葡萄糖注射液0.1mL，1％TTC水溶液（4℃避光保存）0.1mL，混匀放在45℃水溶液中待用。

B3.2.5.3阳性参考血清

用Nm免疫兔制备的诊断血清，未加防腐剂，经预试测定其杀菌抗体滴度较高（1∶3200以上）。

B3.2.5.4滴管与滴头

采用临床上输液用的玻璃输液接头作滴管，滴头采用12号输液针，在砂轮上磨去针头的斜面部分，使其下口呈圆形。

用滴管与滴头滴稀释液应是40滴/mL±

2滴/mL。

它们可用于滴加稀释液、补体、靶菌液、TTC琼脂及待检血清。

如有条件，血清最好用25μL移液器稀释。

B3.3杀菌抗体测定步骤

B3.3.1靶菌液的制备

B3.3.1.1开启A、B或C群Nm菌种，接种到巧克力色琼脂平皿上，37℃二氧化碳孵箱或烛缸培养15～20h，挑取3～5个菌落涂于另一平皿，同上培养10～15h。

B3.3.1.2用Nm诊断血清和生理盐水进行玻片凝集及显微镜检查，以核实菌种。

B3.3.1.3菌种被确证以后，取其菌苔，混匀于2mL灭菌脱脂牛奶管中，制成浓菌液，分装若干支小试管，每管约0.2mL，置—20℃以下保存，Nm可存活3～6个月。

B3.3.1.4需用靶菌时，取出一支上述牛奶菌种管，熔化后立即转种并放在4℃冰箱内保存，供每日分离靶菌制作菌悬液，可备用2周。

在测定抗体的过程中，每次所用靶菌传种的代数保持一致。

B3.3.1.5从所分离的靶菌平皿上挑取3～5个典型菌落，涂抹转种1/4巧克力色琼脂平皿，37℃烛缸培养4～6h，刮取菌苔，于盛有3.5mL左右稀释液的试管壁上用白金耳将其充分研磨，制成轻度混浊的均匀菌悬液，其光密度值相当于0.1。

B3.3.1.6取出上述菌悬液2mL加到0.5cm的比色杯内，在波长为540nm的分光光度计上测其光密度值。

B3.3.1.7稀释液用量按式（B1）计算：

X＝OD×

10—0.1……………………………（B1）

式中：

X——稀释液用量，mL；

OD——光密度值。

按照式（B1）计算稀释液用量，然后往里加入0.1mL靶菌悬液，此时相当于光密度值为0.1的靶菌液作了10倍稀释。

吹吸均匀后，由其开始再连续作10倍稀释至10（上标始）－5（上标终）稀释度，以菌液的最终浓度为每毫升含4000个菌落形成单位为宜。

稀释时每个稀释度更换一个移液枪头。

B3.3.1.8稀释好的靶菌悬液在1h内用完。

若室温较高，可将菌液管置冰浴中，以防靶菌迅速死亡。

B3.3.2杀菌抗体的测定

B3.3.2.1先在微滴板每孔内加1滴相当于25μL的稀释液。

B3.3.2.2用移液器从每排第一孔内加25μL经56℃30min灭活的待检血清，吹吸5～10次后吸出25μL至下一孔，如此作连续倍比稀释至最后一孔。

每份血清分别用一支移液枪头。

B3.3.2.3从低温冰箱内取出补体，于37℃温水中摇动将其速溶，每孔加一滴。

若补体已冷冻干燥，可往安瓿内加相当于补体血清原体积的稀释液，使其融化后即刻使用。

B3.3.2.4每孔加一滴稀释成合适浓度的靶菌菌液，微滴板置微型振荡器上中速振荡5min，再在37℃培养25min，取出后重复上述振荡。

B3.3.2.5每孔加2滴已熔化冷至45℃左右的TTC琼脂后，微滴板置37℃烛缸内培养15～20h后观察结果。

B3.3.2.6每次试验需做下列对照：

阳性参考血清对照；

4孔补体对照（稀释液、补体、菌液各一滴，检查补体自然杀菌活性）；

4孔细菌生长对照（稀释液、灭活补体和靶菌菌液各1滴）。

每次检测时至少每5块微滴板中应有一组上述三种对照试验。

B3.3.2.7往各孔滴完靶菌菌液之后，应将该菌液两滴分别滴加到一个巧克力色琼脂平皿的一端，沿着划好的两条线倾斜下流，于37℃烛缸内同时培养，次日检查每滴靶菌的菌落数及其纯度。

B3.3.2.8判断结果时，先检查上述三种对照试验的结果：

补体的和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点状小菌落；

阳性参考血清应达到原来确定的杀菌滴度。

若所试各孔中红色点状菌落数目明显地少于补体对照孔或不出现红色点状菌落时，则判断为杀菌阳性；

如果所试孔中的菌落数目接近补体对照孔的一半或更多时，则判断为杀菌阴性。

B3.3.2.9根据红色点状菌落数目的多少，以符号“＋”记录试验结果。

若补体及靶菌生长对照各孔的细菌正常生长时，应出现众多红色点状菌落，可记为“＋＋＋＋”。

当所试各孔与其比较，菌落数减少30％以下，记为“＋＋＋”；

减少50％左右记为“＋＋”；

减少70％左右记为“＋”；

每孔少于10个菌落则记为“±

”。

以细菌生长成呈“＋”及以下者判断为杀菌阳性；

以“＋＋”及以上者判为杀菌阴性。

以出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀菌抗体的最高滴度。

附录C

（提示的附录）

胶乳凝集试验

C1目的

应用胶乳凝集试验测定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗原，辅助流脑临床诊断。

C2材料

C2.110％胶乳颗粒（LatexPartic1es，Lx）悬液，颗粒直径为0.81μm。

C2.2从兔免疫血清中提纯的抗A、B和C群Nm的IgG。

C2.3在洁净玻璃板上，用红漆画两排红圈，其直径为3.5cm左右，漆干后备用。

C2.4pH8.2，0.1mol/L硼酸盐缓冲液。

C2.5BSA。

C2.6白明胶。

C2.7戊二醛。

C2.8叠氮钠。

C2.9怀疑流脑病人的CSF或急性期血清或尿液。

C3试验方法

C3.1兔抗不同群Nm的IgG致敏Lx。

C3.1.1将10％Lx悬液用硼酸缓冲液再稀释80倍。

C3.1.2取稀释的Lx悬液1个体积分别加等体积合适浓度的兔抗不同群Nm的IgG，置25mL容量的三角瓶中。

C3.1.3在37℃水浴中旋转（120r/min）振荡瓶中的反应物，致敏Lx2h。

必要时可在每毫升Lx中加25％戊二醛10～20μL，这将有助于Lx吸附IgG。

C3.1.4离心致敏过的Lx（3000r/min，30min），用1mL吸管小心吸取上清液，计量后弃之；

再加含有0.1％BSA的硼酸盐缓冲液（Borate－BufferedSolutionContainingBSA，BBSB），混悬Lx，同上离心，弃上清，除去游离的IgG；

照此重复洗涤Lx3次。

C3.1.5用BBSB液再将Lx恢复到致敏时的浓度，加叠氮钠至终浓度为0.1％，置4℃备用3～6个月。

C3.1.6用正常兔IgG同上步骤致敏Ix作为阴性对照。

C3.2以胶乳凝集试验检测疑似流脑病人标本内Nm群特异性抗原。

C3.2.1病人标本的处理：

CSF离心（3000r/min，30min），取上清，沉淀部分作细菌培养；

急性期血液（2mL），分离血清，置56℃将其灭活30min；

急性期尿液5mL加20mL无水乙醇，置4℃1～2h，离心（3000r/min，