09级基因工程期末复习材料6Word文档下载推荐.docx

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拷贝数：

指某目的基因在某一生物群体或个体中存在的个数.单拷贝就是该基因在基因组中只有一个,多则指有多个。

不同构型质粒DNA电泳图

核酸分离纯化是原则：

a保持核酸分子以及结构的完整性b防止核酸的生物降解

核酸分离纯化的一般程序：

材料的选择与预处理→破碎细胞与提取→分离纯化

DNA纯化最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子）、DNA沉淀可用玻璃棒挑或者离心沉淀

DNA凝胶电泳的影响因素：

带电颗粒的物理性状，支持物介质，电泳强度，缓冲液离子强度

凝胶染色：

EB液/SYBRGreenⅠ/Goldview

核酸分子杂交技术基本原理：

具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特意地复性成双链

DNA的化学降解测序：

经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测DNA分子的碱基序列（5→’3’）

DNA序列的读取是逆电泳方向进行的

Sanger双脱氧链终止法读取的碱基序列是待测DNA模板的互补链，而非模板链本身

DNA纯化过程中的缺点：

加剧DNA的丢失和损伤的可能性。

Sanger中载体的存在不但不会影响测序的结果，反而有利于测序的进行，因为在实际操作中，引物往往不得与待测DNA的3’端互补，而是与载体克隆位点的两侧序列互补，这样可以测定完整的DNA序列

DNA测序通常包括克隆、测序反应和读序三个步骤，

1、DNA的分离与抽提：

方法；

1.酚—氯仿抽提法

使用酚的优点：

1.有效变性蛋白质；

2.抑制了DNase的降解作用。

用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

1.减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

2.异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定

2.盐析法

3.氯化铯密度梯度离心法

4.固相萃取法

2、DNA提取常见问题，原因分析及其对策

①问题一：

DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因：

1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子

对策：

1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）

②问题二：

DNA降解。

1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融

1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融

2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液

3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量

4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔

5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌

6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融

③问题三：

DNA提取量少。

1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失

1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料

2.动植物要匀浆研磨充分；

G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁

3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）

4.低温沉淀，延长沉淀时间

5.加辅助物，促进沉淀

6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒

3、p63猪肝脏总RNA的提取？

RNA提取常见问题，原因分析及其对策

猪肝脏总RNA的提取：

一、准备试剂：

氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。

二、操作步骤：

1.匀浆处理：

将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1mlTRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

2.将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3.可选步骤：

如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×

g离心10分钟，取上清。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。

取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6.2-8℃10000×

g离心15分钟。

样品分为三层：

底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。

用异丙醇沉淀水相中的RNA。

每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8.2-8℃10000×

g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

移去上清。

9.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。

每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。

2-8℃不超过7500×

g离心5分钟，弃上清。

10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。

加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS，用枪头吸打几次，55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。

RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

RNA的降解

（1）新鲜细胞或组织的RNA降解

RNA降解：

1.裂解液的质量2.外源RNase的污染3.裂解液的用量不足；

4.组织裂解不充分5.另外某些富含内源酶的样品（如脾脏，胸腺等），很难避免RNA的降解。

建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。

（2）冷冻样品的RNA降解

1.样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。

样品要相对小一点；

2.先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；

3.样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。

OD260/OD280比值偏低

（1）蛋白质污染；

（2）苯酚残留；

（3）抽提试剂残留；

（4）设备限制。

电泳带型异常

（1）非变性电泳：

上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。

（2）变性电泳条带变淡：

EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；

（3）甲醛的质量不高

④问题四：

下游实验效果不佳

（1）RNA降解；

（2）抽提试剂的残留；

（3）样品中杂质的残留；

（4）DNA污染。

4、已知单链RNA的序列，分别用sanger和化学裂解法测定其序列，写出操作过程。

？

①Sanger双脱氧链终止法：

原理：

1DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对原则复制

2新合成的链

3复制可以在体外进行

42’和3’双脱氧的ddNTP会使复制终止（双脱氧链终止）

DNA聚合酶能够利用单链DNA作模板，合成出对应的DNA互补链，但在反应过程中，如果2’，3’—双脱氧链核苷酸三磷酸底物掺入到寡核苷酸链的3’端，DNA链的延伸反应即被终止。

在4个反应体系中分别加入一种ddNTP反应底物（ddCTP、ddATP、ddGTP、ddTTP）以及DNA模板、合成引物、DNA聚合酶Ⅰ、一定浓度是dNTP（dCTP、dATP、dGTP、dTTP，其中有一种是带32P放射性标记的），使DNA链的合成随机终止于某一特定ddNTP。

最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影技术读出待测DNA模板的碱基序列。

步骤：

1.分离待测核酸模板

2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP（包括放射性标记dATP，例如?

32PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。

3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。

当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。

ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP（如ddATP），则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基（如A）处。

所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA3’末端都为同一种双脱氧碱基。

5.放射自显影。

根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

Sanger双脱氧链终止法的技术要点

1制备单链DNA模板，即待测序的DNA链

2制备一小段模板链

3特殊的DNA多聚酶

4制备2’和3’双脱氧的ddNTP

②化学降解法测序：

（1）待测模版DNA分子的制备：

一般用限制性内切核酸酶将待测DNA分子切割成250~300bp的片段，然后用碱性磷酸酶除去DNA片段5’端的磷酸根，最后用T4多核苷酸激酶和[r32P]ATP，使DNA片段的5’端带上放射性核酸标记。

（2）化学降解待测模版的DNA分子：

纯化并碱变性待测DNA片段，回收其中的一条单链，分装在4支试管中进行上述4组特异性切割反应。

4组反应分别产生大小不同且具有共同标记末端的寡核苷酸片段混合物。

（3）待测模版DNA分子的序列分析：

通过聚丙烯酰胶凝胶电泳将上述4组反应的寡核苷酸片段进行分离，经放射自显影后即可从X光片上读出DNA序列。

5、P87实验设计：

DNA片段之间的连接

答：

如平末端的连接：

直接用T4DNA连接酶

先用末端脱氧核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上PolydApolyT尾巴后，再用DNA连接

用衔接物连接平末端DNA分子

④DNA接头连接法

DNA序列测定法：

DNA的化学降解测序法

1、不对称粘性末端：

两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；

载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；

非重组克隆的背景较低；

外源DNA可以定向插入到载体中。

2、对称性粘性末端；

线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；

重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；

外源DNA会以两个方向插入到载体中。

6、在进行DNA重组研究时，如何防止DNA酶Ⅰ的污染。

1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：

有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）

3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。

4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6.设置专用实验室，所有器械等应为专用。

7、核酸纯度与浓度分析

纯度：

纯净核酸：

OD260/OD280≈1.7-2.0OD260/OD230＞2.0

有蛋白质或酚污染OD260/OD280＜1.7

有RNA污染或DNA降解OD260/OD280＞2.0或OD260/OD230＜2.0

浓度：

若OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/ml则质粒DNA浓度（μg/μl）=稀释倍数×

OD260×

50

第二章基因工程工具酶

大肠杆菌可具有4种表型：

1R+KM+K野生型，具有完整的限制和修饰功能

2R-KM+K限制缺陷型，不能降解外源DNA，但具有修饰功能这类突变株常用于转化实验

3R-KM-K限制和修饰缺陷型，既无限制功能又无修饰功能，常用于转化实验

4R+KM-K修饰缺陷型，缺乏修饰自身DNA的功能

限制性核酸内切酶的特点

1识别DNA分子中4→8个碱基的特定序列

2呈旋转对称,回文结构

3切割位点用↓或/表示

4识别序列在内部、两侧

限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二脂键断开的内脱氧核苷酸酶

目前发现有限制性核酸内切酶的生物主要是细菌、少数霉菌和蓝藻

限制性核酸内切酶可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型酶

限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列。

同裂酶：

来源不同，具有相同的识别序列。

同裂酶可以具有不同的或相同的切割位点

同尾酶：

识别序列不同，切割DNA分子所得的DNA片段具有相同的黏性末端

对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样切割的结果产生的DNA片段称为黏性末端。

DNA片段末端的3’端比5’端长称为3’粘性末端，DNA片段末端的3’端比5’端短称为5’粘性末端。

两条多聚核苷酸链上磷酸二脂键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段是平齐的称为平末端

DNA分子片段化方法

单酶切DNA样品是环状，完全酶切后产生于识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同

双酶切环状DNA分子完全酶切的结果，产生的DNA片段数是两种限制性核酸内切酶序列数之和；

线性DNA分子，产生的DNA片段数是两种限制性核酸内切酶序列数之和+1。

先较低盐浓度缓冲液的酶进行切割后较高盐浓度缓冲液的酶进行切割；

先用最适反应温度较低的酶进行酶切后用较高最适反应温度的酶进行酶切

部分酶切选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。

原因有底物DNA的初读低、识别序列的甲基化、酶用量的不足以及反应缓冲液和温度不适宜等。

大肠杆菌DNA连接酶催化双链DNA片段互补黏性末端之间连接;

T4DNA连接酶不仅可以催化双链DNA片段互补黏性末端之间连接，还可以催化双链DNA片段平末端之间连接。

大肠杆菌DNA连接酶反应系统中辅助因子NAD；

T4DNA连接酶反应系统中辅助因子ATP

T4-DNA连接酶作用

1修复双链DNA的单连缺口

2连接DNA—DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，后者反应速度慢

3连接完全断开的两个平头双链DNA分子，属分子间连接，但速度慢，在高浓度的底物和酶的作用下方可进行

DNA连接酶的特点：

能催化外源DNA和载体分子之间连接形成重组DNA分子。

DNA片段连接前后识别序列的变化

碱性磷酸酶的作用：

去除5’—磷酸基团，防止自身连接环化，把5’—P→5’—OH

影响DNA连接酶作用的影响：

反应温度、T4DNA连接酶的用量、提高外源片段与载体的浓度比值（10-20倍）

DNA聚合酶

1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ5’→3’聚合酶活性3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性,其中5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性有修复功能,制作探针

2大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（klenowDNA聚合酶）枯草芽孢杆菌蛋白酶裂解得到,该酶失去了全酶5’→3’外切酶活性,具有5’→3’聚合酶活性3’→5’外切酶活性

3耐高温DNA聚合酶,主要用于多聚酶链式反应（PCR）

4反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶,5’→3’聚合酶活性（cDNA合成方向5’→3’）RNaseH的活性（3’→5’RNA外切酶活性5’→3’RNA外切酶活性）

不同组织、不同发育阶段的CDNA文库是有所差异的（√）

一般而言，没有原核生物cDNA文库，cDNA文库构建——检测mRNA完整性

1、回文结构：

短的回文结构可能是一种特别的信号，如限制性内切酶

的识别位点（旋转对称）。

较长的回文结构容易转化成发夹结构。

回文结构（基数核苷酸）（切下来都是黏性末端。

2、星号活性：

p46某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶在酶切同一种DNA片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性则称星号活性。

导致Star活性产生原因：

（1）高甘油含量

（2）限制性内切核酸酶用量过高

（3）低离子强度（4）高pH（5）含有有机溶剂（6）有非Mg2+的二价阳离子存在

3、提高平末端DNA片段连接效率的方法？

DNA片段末端同聚物加尾后进行连接

粘性末端修饰成平末端后进行连接

DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接

DNA片段加连杆或衔接头后连接

4、大肠杆菌DNA聚合酶

具有5’-3’DNA聚合酶活性、5’-3’外切核酸酶活性、3’-5’外切核酸酶活性

5、逆转录酶具有RNA指导的DNA聚合酶活性、RNaseH活性、DNA指导的DNA聚合酶活性。

商品化逆转录酶（AMVAMV反转录酶（鸟类骨髓细胞性白血病病毒）M—MLV反转录酶（Moloney鼠白血病病毒）

6、p95为了从生物材料中高效提取RNA，如何控制RNA酶活性，消除RNA酶的降解活性？

（一）消除生物材料内源性RNA酶的干扰。

主要是在组织细胞裂解液中介入RNA酶抑制剂和变性剂，如异硫氰酸胍、盐酸胍、尿素。

由于RNA酶活性的最适PH接近中性，因此组织细胞裂解液的PH偏碱性或偏酸性可部分抑制RNA酶的活性。

（二）消除制备RNA过程中外源性RNA酶的干扰，可采取以下措施：

①对于制备RNA所用的试剂，一般应该用0.1%DEPG处理过的水配制，在37℃处理12小时以上，然后高压灭菌并除去残留的DEPG。

②对于玻璃器皿用180℃干烤3小时以上；

对于塑料器皿，用氯仿充分冲洗。

③制备RNA的过程在超净工作台中进行。

④在制备RNA时操作者应戴口罩和一次性手套，且勤换手套。

7、p66限制性内切核酸酶的作用机制？

限制性内切核酸酶以环状和线性的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3‘-羟基和5’-磷酸基的DNA片段。

8、DNA连接酶有哪些连接方法？

一、具互补粘性末端片段之间的连接二、具平末端DNA片段之间的连接三、DNA片段末端修饰后进行连接

9、哪些工具酶可用于制备带标记的DNA分子（探针）？

大肠杆菌DNA聚合酶

klenow酶T4-DNA聚合酶反转录酶

第三章基因克隆载体

知识点

pSC101、9.09kb第一个成功用于基因克隆实验的天然质粒，低拷贝型。

colE1（大肠杆菌E1）高拷贝型

一个细胞内这种质粒的数量与染色体的数量之比

质粒还提供复制起始位点和决定复制强度（拷贝数）的一些基因。

拷贝数少的（只有1—数个拷贝）质粒称为严紧型质粒；

拷贝数多的（10个以上拷贝）质粒称为松弛型质粒。

不亲和性质粒（不相容性质粒）：

不能在同一宿主细胞中共存的质粒。

亲和性质粒：

能在同一宿主细胞中共存的不同质粒。

质粒载体的三种共同组分：

复制起点、筛选标记、克隆位点（填空）

一般人工构建的质粒是单复制子（是非）

λ噬菌体在E.coli固体、液体培养基中生长不同：

液体：

培养物由浑浊变为澄清固体：

37℃过夜培养形成一个透明的斑点（噬菌斑）

一个噬菌斑中的上百万个噬菌体颗粒均由一个噬菌体无性繁殖所产生

λ噬菌体的主要类型：

插入型（只有一个限制酶切位点可使之插入）、取代型（两个酶切位点）体外重组类型：

置换型、插入型

2个相同的质粒载体可以在同一噬菌体中存在（×

）

由于cosmid克隆载体不含λ噬菌体溶菌生长途径，溶源生长途径和DNA复制系统，所以不会产生子代噬菌体，不能通过溶菌周期（是非）

外源片断克隆在cosmid载体中是以大肠杆菌的形式表现出来，而不是噬菌斑（与质粒不同）（是非）

1、克隆载体

功能：

1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制功能或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件。

具备条件：

1.具有针对受体细胞的亲缘性和亲和性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点3.具有较高的外源DNA装载能力4.具有多种单一的限制性内切酶识别、切割位点5.具有合适的帅选标记

一般特性：

1.对受体细胞的可转移性2.自主复制功能3.显著的帅选标记4.特定的多克隆位点5.安全性

3、蓝白斑筛选原理（重点）

重组质粒转化宿主细胞后还需对转化菌进行筛选鉴定。

利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。

现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，此称lacZ’基因。

LacZ’基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。

宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的