质粒制备Word下载.docx
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本实验介绍最常用的碱裂解法和煮沸法提取质粒DNA。
1.碱变性法
碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。
在pH值高达12.6的碱性环境中,染色体的线性DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而被变性;
共价闭环质粒DNA的大部分氢键也断裂,但两条互补链不会完全分离,仍会紧密地结合在一起。
用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时,因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此可以迅速复性;
而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,不能复性,它们相互缠绕形成不溶性网状物,而复性的质粒DNA恢复原来构型,保持可溶性状态。
通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,用酚-氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA,然后用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀。
2.煮沸法
细胞用含有TritonX-100的缓冲液处理,溶解细胞膜。
用溶菌酶酶解细菌细胞,然后在高温条件下,使细胞裂解,破坏细菌细胞壁,有助于解开DNA链的碱基对,并使蛋白质和染色体DNA变性。
而闭环质粒DNA配对虽被破坏,但双链彼此不分开,当温度下降时恢复成超螺旋。
变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来,质粒DNA仍留在上清液中。
离心后的上清液再用异丙醇或乙醇处理,沉淀出质粒DNA。
以上两种制备方法的实验过程中,由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用,染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在,因此,采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外,还可能有少部分染色体DNA和RNA,必要时可进一步纯化。
提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA一般并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等,因此不必除去。
【试剂与器材】
(一)菌种和培养基
1.大肠杆菌DH5α(含质粒pT-GFP,该质粒为T载体联上了绿色荧光蛋白GFP基因的重组质粒)。
2.LB液体培养基(Luria-Bertani):
称取蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeastextract)5g,NaCl10g,溶于800mL去离子水中,用NaOH调pH至7.2,加去离子水至总体积1L。
分装于150mL三角瓶中,每瓶50mL,置高压蒸气锅以1.034×
105Pa,121℃灭菌20分钟。
3.氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液:
用无菌水配成10mg/mL水溶液,过滤除菌,分装成小份存于灭菌有盖离心管中,-20℃保存备用,不宜反复冻溶。
(二)试剂
1.溶液I:
50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris.Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)。
高压灭菌15min,储存于4℃冰箱。
2.溶液Ⅱ:
0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释),1%SDS(从10%SDS母液中稀释,SDS母液可室温保存),现配现用。
3.溶液III:
5mol/LKAc60mL,冰醋酸11.5mL,H2O28.5mL,高压灭菌,4℃冰箱保存。
溶液终浓度为:
K+3mol/L,Acˉ5mol/L。
4.3mol/L醋酸钠(pH5.2):
800mL水中溶解408.1gNaAc•3H2O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100mL,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。
5.STE缓冲液:
0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris•Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。
6.STET:
0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris•Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0),5%Triton
X-100。
7.TE缓冲液:
10mmo/LTris•Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。
高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
8.RNA酶A母液:
将RNA酶A溶于10mmol/LTris•Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/mL的溶液,于100℃加热15min,使残留的DNA酶失活。
冷却后用1.5mLEppendorf管分装成小份保存于-20℃。
9.溶菌酶(10mg/ml):
用10mmol/LTris.Cl,PH8.0,新鲜配制。
10.TE饱和酚
(1)
11.酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1):
12.氯仿:
异戊醇(24:
按氯仿:
异戊醇=24:
1体积比加入异戊醇
(2)。
氯仿可使蛋白变性并有助于水相与有机相的分开,异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。
13.电泳所用试剂:
(1)TBE缓冲液(5×
):
称取Tris54g,硼酸27.5g,并加入0.5MEDTA(pH8.0)20mL,定溶至1000mL。
(2)上样缓冲液(6×
0.25%溴酚蓝,40%(w/v)蔗糖水溶液。
14.异丙醇
15.70%乙醇
(二)设备
超净工作台,微量取液器(20μL,200μL,1000μL),台式高速离心机,恒温振荡摇床,高压蒸汽消毒器(灭菌锅),涡旋振荡器,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
【操作方法】
(一)小量制备
碱变性法:
1.将含有质粒pGFPuv的DH5α菌种划线接种在LB固体培养基(含有100μg/mLAmp)(3)上,37℃培养12-24小时(4)。
用无菌牙签挑取单菌落接种到5mLLB液体培养基(含有100μg/mLAmp)中,37℃振荡培养14~16小时。
2.取1.5mL培养液加入1.5mL离心管中,室温12,000r/min离心1分钟收集菌体(视菌体量多少,可重复此步)。
3.加入100μL预冷的溶液Ⅰ涡旋振荡悬浮菌体(5)。
4.加入新配制的溶液Ⅱ200μL,轻缓上下颠倒离心5次,至溶液澄清(千万不要振荡),冰浴5分钟(6)。
5.立即加入用冰预冷的150μL溶液III,轻柔振荡5~10次(7),冰浴5分钟(8),12,000r/min离心5min。
6.取上清移入干净Eppendorf管中,加入等体积的酚:
1),剧烈振荡20秒。
室温下12,000r/min离心10分钟,可见溶液分三层,上层为质粒DNA溶液,中层为变性的蛋白层,下层为有机相。
7.取上清(6),加入400μL氯仿:
12,000r/min离心10分钟。
(选做)
8.取上清,加入2~2.5倍体积无水乙醇振荡混匀,沉淀DNA,-20℃放置10min(7)。
(或者加1倍异丙醇,室温静置10min),12,000rpm离心10分钟。
9.去上清,加入200μL70%乙醇(8),12000g,2分钟。
洗涤沉淀两次以去盐。
10.将Eppendorf管倒置于一张纸巾上,使液体流出,然后短暂离心,用移液器小心取出残液,这一步操作要格外小心,有时沉淀块贴壁不紧,放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙醇。
(除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,轻缓抽吸,并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时,尽可能使吸头远离核酸沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴)。
11.将沉淀溶于30μLTE缓冲液(pH8.0,含20μg/mLRNaseA)中(9),储于-20℃冰箱中。
如直接酶切,可将沉淀溶于30~50μLddH2O(含20μg/mLRNaseA)。
12.利用比色法测定质粒DNA在260nm和280nm下的光吸收值并计算样品浓度。
13.用1%琼脂糖凝胶电泳观察质粒DNA的纯度和条带情况。
煮沸法
1.取1.5ml培养菌体
(1)置于离心管中,10000g离心1分钟。
2.弃上清
(2),将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。
3.将菌体沉淀悬浮于350ulSTET溶液中,涡旋混匀。
4.加入25ul新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)(3),涡旋振荡3秒钟混匀。
(溶菌酶溶液PH值不能低于8.0,否则溶菌酶就不能有效发挥作用。
)
5.将离心管放入沸水浴中,时间恰为40秒,12000g,离心10分钟。
6.吸出上清移至另一个离心管,或直接用消毒牙签取出沉淀物,在上清中加入40ul5mol/LNaAc(PH5.2)和420ul异丙醇,振荡混匀,室温放置5分钟。
7.12000g,4℃离心5分钟,将Eppendorf管倒置于一张纸巾上,使液体流出,然后短暂离心,用移液器小心取出残液,这一步操作要格外小心,有时沉淀块贴壁不紧,放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙醇或室温直至乙醇挥发殆尽,管内无可见的液体(2-5)分钟。
8.弃上清,加入1ml70%乙醇,12000g,4℃离心2分钟。
按步骤7回收核酸沉淀。
9.加入50ulTE(PH8.0)(含无DNA酶的RNA酶20ug/ml),溶解DNA,稍加振荡,储存于-20℃。
(二)大量制备
1.从平板上挑选一个单菌落,接种到50mL培养基,37℃过夜培养14~16小时。
2.将培养物转入50mL离心管,4,800r/min4℃离心10分钟。
3.沉淀用10mLSTE洗涤,涡旋打匀,4,800r/min4℃离心10分钟。
4.加入3mL溶液I,涡旋,冰浴5分钟。
5.加入6mL溶液Ⅱ(现配),轻柔颠倒数次直至溶液澄清,保持冰浴5分钟。
6.马上加入溶液Ⅲ4.5mL,轻柔颠倒5~10次,得到白色沉淀,冰浴3-5分钟。
7.4,800r/min4℃离心20分钟,取上清,加入0.6倍体积异丙醇,室温放置10分钟,沉淀DNA。
8.4,800r/min室温离心10分钟,去上清,加入75%乙醇,洗涤沉淀。
9.4,800r/min离心10分钟,去上清,吸出痕量剩余乙醇,风干。
10.加入1.5mLTE溶液,溶解沉淀,转入7mL离心管。
11.加入等体积5mol/LLiCl(预冷),颠倒混匀,冰浴10分钟,沉淀大分子RNA。
12.10,000r/min4℃离心10分钟,取上清,加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置10分钟。
13.10,000r/min室温离心10分钟,室温放置20~30分钟。
用700μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀
14.转移至1.5mL离心管,加入等体积13%PEG8000/1.6mol/LNaCl,混匀,冰浴10分钟,沉淀双螺旋质粒DNA。
15.12,000r/min离心10分钟,去上清,加入1mL75%乙醇,洗涤沉淀。
16.12,000r/min离心10分钟,去上清,吸出痕量剩余乙醇,风干。
17.加入600μLTE溶液溶解沉淀。
18.酚、酚:
氯仿:
异戊醇、氯仿:
异戊醇各抽提一次,去除蛋白。
19.将上清转移至另一离心管,加入1/10体积3MNaAc,2倍体积无水乙醇,4℃沉淀10分钟。
20.12,000r/min离心10分钟,去上清,加入1mL75%乙醇,洗涤沉淀。
21.12,000r/min离心10分钟,去上清,吸出痕量剩余乙醇,风干。
22.加入200μLddH2O,溶解质粒。
(三)聚乙二醇沉淀法质粒DNA
这里介绍的方法(R.Tresman,个人通讯)已卓有成效地用于纯化碱裂解法制备的质粒DNA。
1)将核酸溶液[上页步骤22)所得]转入15mlCorex管中,再加3ml用冰预冷的5mol/LLiCl溶液,充分混匀,用SorvallSS34转头(或与其相当的转头)于4℃下以10000转/分离心10分钟。
LiCl可沉淀高分子RNA。
2)将上清转移到另一30mlCorex管内,加等量的异丙醇,充分混匀,用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10000转/分离心10分钏,回收沉淀的核酸。
3)小心去掉上清,敞开管口,将管倒置以使最后残留的液滴流尽。
于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴,敞开管口并将管侄置,在纸巾上放置几分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
4)用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中,于室温放置30分钟。
5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG8000)的1.6mol/LNaCl,充分混合,用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟,以回收质粒DNA。
6)吸出上清,用400μlTE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。
用酚、酚:
氯仿、氯仿各抽1次。
7)将水相转到另一微量离心管中,加100μl10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于4℃以12000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA。
8)吸去上清,加200μl处于4℃以12000g离心2分钟。
9)吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
10)用500μlTE(pH8.0)溶解沉淀1:
100稀释[用TE(pH8.0)]后测量OD260,计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml),然后将DNA贮于-20℃。
【注意事项与提示】
1.碱变性法注意事项
(1)市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。
重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/LTris•Cl(pH8.0)和0.1mol/LTris•Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
(2)氯仿可使蛋白变性并有助于水相与有机相的分开,异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。
(3)培养时应加入筛选压力(抗生素),否则菌体易污染,质粒易丢失;
(4)使用处于对数期的新鲜菌体(老化菌体导致开环质粒增加),细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,培养时间不要超过16小时;
(5)溶液I中各成分的作用:
葡萄糖的作用是分散细胞,EDTA是Ca和Mg等二价金属离子的螯合剂,其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性。
(6)溶液Ⅱ加入后5min内快速用溶液III中和,防止共价闭和环状质粒DNA在强碱环境中暴露时间过长发生不可逆的变性,质粒易被打断;
溶液II中各成分的作用:
NaOH主要是为了溶解细胞,释放DNA,因为在强碱性的情况下,细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的变化;
但NaOH易和空气中的CO2发生反应形成NaCO3,降低了NaOH的碱性,所以必须用新鲜的NaOH。
SDS与NaOH联用,其目的是为了增强NaOH的强碱性,同时SDS能很好地结合蛋白,产生沉淀。
(7)加入溶液II和III后不要剧烈振荡,防止可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中;
(8)复性时间也不宜过长,否则会有基因组DNA的污染;
(9)酚:
异戊醇抽提后,应小心吸取含质粒DNA的上清溶液,防止吸到位于有机相和水相之间的变性的蛋白质,约可吸到420μL;
(10)使用冰乙醇沉淀DNA,并在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀更完全。
(11)沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等;
(12)TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性,pH值为8.0,可防止DNA发生酸解;
(13)溶液III中各成分的作用:
溶液III中的KAC是为了使钾离子置换SDS中的纳离子而形成了PDS,因为十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassiumdodecylsulfate,PDS),而PDS是不溶水的,同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。
2M的醋酸是为了中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和。
基因组DNA一旦发生断裂,就不能再被PDS共沉淀了,所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase;
得到的质粒样品一般用含RNase(50ug/ml)的TE缓冲液进行溶解,不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时,多数情况下你能看到三条带即超螺旋、线性和开环这三条带。
2.煮沸法注意事项
(1)从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA+株,如HB101)制备质粒时,建议不使用煮沸法。
因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A,以后在Mg2+存在下温育时,质粒DNA可被降解。
用70%乙醇洗涤一步前增加用酚:
氯仿进行抽提步骤,可避免此问题。
(2)的细菌沉淀和核酸沉淀中去除上清液时,一定要除尽。
否则质粒DNA不能被限制酶
切割。
(3)添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
(二)聚乙二醇沉淀法质粒DNA常见问题及可能原因
1.提取的质粒DNA不纯:
变性不充分;
关键步骤反应时间过短;
离心时间或速度不够。
2.提取的质粒DNA呈涂布状:
操作过程中用力过猛,动作过大;
操作系统内有污染。
3.与染色体DNA分离不全:
变性过程不完全;
试剂配制有问题(成分,浓度或pH)。
【实验安排】
1.第一天:
上午:
配制所需的各种试剂及培养基,装好枪头、离心管、牙签等耗材,并在高温下灭菌。
下午:
接种摇菌
2.第二天:
收取培养物,提取质粒DNA
比色和电泳检测DNA的浓度和纯度以备酶切
【实验报告要求与思考题】
1.提交质粒DNA的浓度结果及电泳检测图谱
2.质粒的基本性质有哪些?
3.碱法提取DNA的过程中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ生化作用原理分别是什么?
4.在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题?
提质粒流程图: