质粒制备Word下载.docx

1、本实验介绍最常用的碱裂解法和煮沸法提取质粒DNA。1. 碱变性法 碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。在pH值高达12.6的碱性环境中，染色体的线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而被变性；共价闭环质粒DNA的大部分氢键也断裂，但两条互补链不会完全分离，仍会紧密地结合在一起。用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此可以迅速复性；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能复性，它们相互缠绕形成不溶性网状物，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通

2、过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，用酚-氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA，然后用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀。2.煮沸法 细胞用含有TritonX100的缓冲液处理，溶解细胞膜。用溶菌酶酶解细菌细胞，然后在高温条件下，使细胞裂解，破坏细菌细胞壁，有助于解开DNA链的碱基对，并使蛋白质和染色体DNA变性。而闭环质粒DNA配对虽被破坏，但双链彼此不分开，当温度下降时恢复成超螺旋。变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来，质粒DNA仍留在上清液中。离心后的上清液再用异丙醇或乙醇处理，沉淀出质粒DNA。 以上两种制备方法的实验过程中，由于

3、细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，必要时可进一步纯化。 提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA一般并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等，因此不必除去。【试剂与器材】（一）菌种和培养基1.大肠杆菌DH5（含质粒pT-GFP，该质粒为T载体联上了绿色荧光蛋白GFP基因的重组质粒）。2.LB液体培养基（Luria-Bertani） ：称取蛋白胨（Tryptone）10 g，酵母提取物（Yeast extract） 5

4、 g，NaCl 10 g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.2，加去离子水至总体积1L。分装于150 mL三角瓶中，每瓶50 mL，置高压蒸气锅以1.034105Pa，121灭菌20分钟。3.氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）母液：用无菌水配成 10 mg/mL水溶液，过滤除菌，分装成小份存于灭菌有盖离心管中，-20保存备用，不宜反复冻溶。（二）试剂1.溶液I：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl （pH8.0），10mmol/L EDTA （pH8.0）。高压灭菌15min，储存于4冰箱。2.溶液：0.2 mol/L NaOH（临用前用10m

5、ol/L NaOH母液稀释），1 SDS（从10% SDS母液中稀释，SDS母液可室温保存），现配现用。3.溶液III：5 mol/L KAc 60mL，冰醋酸11.5mL，H2O 28.5mL，高压灭菌，4冰箱保存。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。4.3 mol/L 醋酸钠 （pH5.2）：800 mL水中溶解408.1g NaAc3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，分装后高压灭菌，储存于4冰箱。5.STE缓冲液：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl（pH8.0），1mmol/L EDTA （pH8.0）。6.STET：0.

6、1 mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl（pH8.0），1mmol/L EDTA （pH8.0）， 5% TritonX-100。7.TE缓冲液：10 mmo/L TrisCl （pH8.0），1 mmol/L EDTA （pH8.0）。高压灭菌后储存于4冰箱中。8.RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L TrisCl（pH7.5），15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL的溶液，于100加热15min，使残留的DNA酶失活。冷却后用1.5mL Eppendorf管分装成小份保存于-20。9.溶菌酶（10mg/ml）：用10mmol/L Tris.Cl, PH

7、8.0, 新鲜配制。10.TE饱和酚（1）11.酚:氯仿:异戊醇 （25:24:1）：12.氯仿：异戊醇（24:按氯仿:异戊醇24:1体积比加入异戊醇（2）。氯仿可使蛋白变性并有助于水相与有机相的分开，异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。13.电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 （5）：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA （pH8.0） 20mL，定溶至1000mL。 （2）上样缓冲液 （60.25% 溴酚蓝，40% （w/v） 蔗糖水溶液。14.异丙醇15.70乙醇（二）设备超净工作台，微量取液器（20L, 200L, 1000L），台式高速离心机，恒温振

8、荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。【操作方法】（一）小量制备碱变性法：1.将含有质粒pGFPuv 的DH5菌种划线接种在LB固体培养基（含有100 g/mL Amp）（3）上，37培养12-24小时（4）。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mL LB液体培养基（含有100 g/mL Amp）中，37振荡培养1416小时。2.取1.5 mL培养液加入1.5 mL 离心管中，室温12, 000 r/min离心1分钟收集菌体（视菌体量多少，可重复此步）。3.加入100 L预冷的溶液涡旋振荡悬浮菌体（5）。4.加入新配制的溶液200L，轻缓上下颠倒离心5

9、次，至溶液澄清（千万不要振荡），冰浴5分钟（6）。5.立即加入用冰预冷的150L溶液III，轻柔振荡510次（7），冰浴5分钟（8），12, 000 r/min离心5min。6.取上清移入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚:1），剧烈振荡20秒。室温下12,000 r/min离心10分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为变性的蛋白层，下层为有机相。7.取上清（6），加入400L氯仿:12,000r/min 离心10分钟。（选做）8.取上清，加入22.5倍体积无水乙醇振荡混匀，沉淀DNA，-20放置10min（7）。（或者加1倍异丙醇，室温静置10min），12,000rpm

10、 离心10分钟。9.去上清，加入200L 70%乙醇（8），12000g，2分钟。洗涤沉淀两次以去盐。10.将Eppendorf管倒置于一张纸巾上，使液体流出，然后短暂离心，用移液器小心取出残液，这一步操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙醇。（除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴）。11.将沉淀溶于30L TE缓冲液（pH8.0，含20g /mL RNaseA）中（9），储于-20冰箱中。如直接酶切，可将沉淀溶于3050L ddH2O

11、（含20g /mL RNaseA）。12.利用比色法测定质粒DNA在260 nm和280 nm下的光吸收值并计算样品浓度。13.用1%琼脂糖凝胶电泳观察质粒DNA的纯度和条带情况。煮沸法 1.取1.5ml 培养菌体（1）置于离心管中,10000离心1分钟。2.弃上清（2），将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。3.将菌体沉淀悬浮于350ul STET 溶液中, 涡旋混匀。4.加入25ul 新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml） （3）, 涡旋振荡3 秒钟混匀。（溶菌酶溶液PH值不能低于8.0，否则溶菌酶就不能有效发挥作用。）5.将离心管放入沸水浴中,时间恰为40秒，12000g，离心10分钟。6

12、.吸出上清移至另一个离心管，或直接用消毒牙签取出沉淀物，在上清中加入40ul 5mol/L NaAc（PH5.2）和420ul 异丙醇，振荡混匀，室温放置5分钟。7.12000g，4离心5分钟，将Eppendorf管倒置于一张纸巾上，使液体流出，然后短暂离心，用移液器小心取出残液，这一步操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙醇或室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（25）分钟。8.弃上清， 加入1ml70乙醇，12000g，4离心2分钟。按步骤7回收核酸沉淀。9.加入50ul TE（PH8.0）（含无DNA酶的RNA酶 20ug/ml），溶解DNA，稍加振荡，储存

13、于20。（二）大量制备1.从平板上挑选一个单菌落，接种到50mL培养基，37过夜培养1416小时。2.将培养物转入50mL离心管，4,800r/min 4离心10分钟。3.沉淀用10mL STE洗涤，涡旋打匀， 4,800r/min 4离心10分钟。4.加入3mL溶液I，涡旋，冰浴5分钟。5.加入6mL溶液（现配），轻柔颠倒数次直至溶液澄清，保持冰浴5分钟。6.马上加入溶液 4.5mL，轻柔颠倒510次，得到白色沉淀，冰浴35分钟。7.4,800r/min 4离心20分钟，取上清，加入0.6倍体积异丙醇，室温放置10分钟，沉淀DNA。8.4,800r/min室温离心 10分钟，去上清，加入75

14、%乙醇，洗涤沉淀。9.4,800r/min离心 10分钟，去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。10.加入1.5mL TE溶液，溶解沉淀，转入7mL离心管。11.加入等体积5mol/L LiCl （预冷），颠倒混匀，冰浴10分钟，沉淀大分子RNA。12.10,000r/min 4 离心10分钟，取上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。13.10,000r/min 室温离心10分钟，室温放置2030分钟。用700l含无酶的胰酶（20g/ml ）的（pH8.0）溶解沉淀14.转移至1.5mL离心管，加入等体积13% PEG8000/1.6mol/L NaCl，混匀，冰浴10分钟，沉淀双螺旋

15、质粒DNA。15.12,000r/min离心10分钟，去上清，加入1mL 75%乙醇，洗涤沉淀。16.12,000r/min离心10分钟，去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。17.加入600L TE溶液溶解沉淀。18.酚、酚：氯仿：异戊醇、氯仿：异戊醇各抽提一次，去除蛋白。19.将上清转移至另一离心管，加入1/10体积3M NaAc，2倍体积无水乙醇，4沉淀10分钟。20.12,000r/min 离心10分钟，去上清，加入1mL 75%乙醇，洗涤沉淀。21.12,000r/min 离心10分钟，去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。22.加入200L ddH2O，溶解质粒。（三）聚乙二醇沉淀法质粒 这里

16、介绍的方法（R.Tresman,个人通讯）已卓有成效地用于纯化碱裂解法制备的质粒。）将核酸溶液上页步骤22）所得转入15mlorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用orvall SS34 转头（或与其相当的转头）于下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子。）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀，用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏， 回收沉淀的核酸。）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置

17、相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。）用500l含无酶的胰酶（20g/ml ）的（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。）加500l含13（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于以12000g离心分钟，以回收质粒。）吸出上清，用400l TE（pH8.0）溶解质粒沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽次。）将水相转到另一微量离心管中，加100l 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于以12 000g离心分

18、钟，以回收沉淀的质粒。）吸去上清，加200l处于以12 000g离心分钟。）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10）用500l（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释用（pH8.0） 后测量260，计算质粒的浓度（26050g质粒/ml）， 然后将贮于20。【注意事项与提示】1. 碱变性法注意事项（1）市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1的8-羟基喹啉 （作为抗氧化剂），并用等体积的0.5mol/L TrisCl （pH8.0）和0.1mol/L TrisCl（pH8.0）

19、缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。（2）氯仿可使蛋白变性并有助于水相与有机相的分开，异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。（3）培养时应加入筛选压力（抗生素），否则菌体易污染，质粒易丢失；（4）使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加），细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时；（5）溶液I中各成分的作用：葡萄糖的作用是分散细胞，EDTA是Ca和Mg等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性。（6）溶液加入后5min内快速用溶液III中和，防止共价闭和环状质粒DNA在

20、强碱环境中暴露时间过长发生不可逆的变性，质粒易被打断；溶液II中各成分的作用：NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应形成NaCO3，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。（7）加入溶液II 和III后不要剧烈振荡，防止可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中；（8）复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染；（9）酚:异戊醇抽提后，应小心吸取含质粒

21、DNA的上清溶液，防止吸到位于有机相和水相之间的变性的蛋白质，约可吸到420L；（10）使用冰乙醇沉淀DNA，并在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀更完全。（11）沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等；（12）TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性，pH值为8.0，可防止DNA发生酸解；（13）溶液III 中各成分的作用：溶液III 中的KAC是为了使钾离子置换 SDS 中的纳离子而形成了 PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate,PDS），而 P

22、DS 是不溶水的，同时一个 SDS 分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M 的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和。基因组 DNA 一旦发生断裂，就不能再被 PDS 共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase； 得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下

23、你能看到三条带即超螺旋、线性和开环这三条带。2. 煮沸法注意事项（1）从表达内切核酸酶的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶，以后在Mg2+存在下温育时，质粒DNA可被降解。 用70乙醇洗涤一步前增加用酚：氯仿进行抽提步骤，可避免此问题。（2）的细菌沉淀和核酸沉淀中去除上清液时，一定要除尽。否则质粒DNA不能被限制酶切割。（3）添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。（二）聚乙二醇沉淀法质粒常见问题及可能原因1.提取的质粒DNA不纯：变性不充分；关键步骤反应时间过短；离心时间或速度不够。2.提取的质粒DNA呈涂布状：操作过程中用力过猛，动作过大；操作系统内有污染。3.与染色体DNA分离不全：变性过程不完全；试剂配制有问题（成分，浓度或pH）。【实验安排】1.第一天：上午：配制所需的各种试剂及培养基，装好枪头、离心管、牙签等耗材，并在高温下灭菌。下午：接种摇菌2.第二天：收取培养物，提取质粒DNA比色和电泳检测DNA的浓度和纯度以备酶切【实验报告要求与思考题】1.提交质粒DNA的浓度结果及电泳检测图谱2.质粒的基本性质有哪些？3.碱法提取DNA的过程中溶液、生化作用原理分别是什么？4.在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？ 提质粒流程图：