作物DNA标记辅助育种144页文档资料Word文档格式.docx
《作物DNA标记辅助育种144页文档资料Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《作物DNA标记辅助育种144页文档资料Word文档格式.docx（85页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
arbitrarilyprimedPCR
BC
Backcross
BIL
backcrossinbredlines
BSA
bulkedsegregantanalysis
CAPS
cleavedamplifiedpolymorphicsequence
cDNA
complementaryDNA
cM
CentiMorgans
DAF
DNAamplificationfingerprinting
DH
doubledhaploid
DNA
deoxyribonucleicacid
EST
expressedsequencetag
ISSR
inter-simplesequencerepeats
MAS
markerassistedselction
NIL
near-isogeniclines
PCR
polymerasechainreaction
PFGE
pulsed-fieldgelelectrophoresis
QTL
quantitativetraitloci
RAPD
randomamplifiedpolymorphismicDNA
RFLP
restrictionfragmentlengthpolymorphism
RGA
Resistancegeneanalogs
RI
recombinantinbred
RIL
recombinantinbredlines
SCAR
sequencecharacterizedamplifiedregion
SNP
singlenucleotidepolymorphism
SSR
simplesequencerepeats
STS
sequence-taggedsite
VNTR
variablenumberoftandemrepeats
前言
在农业生产中，选用优良品种是最重要的环节之一。
一个理想的优良品种不仅要产量高、品质好，而且要抗病虫、抗逆性强。
现有的作物栽培品种尽管各有优点，但都还存在某些不足。
有的产量较高，但品质不够理想；
有的品质较好，但产量低。
抗病、抗虫、抗逆等性状更是千差万别，有的只抗病不抗虫，有的只抗某一或少数几种病害或虫害而不抗其它病害或虫害。
几乎没有一个栽培品种在产量、品质、抗性上都能满足生产的要求。
将不同品种各自具有的优良性状通过品种间的杂交集中到一个品种中，一直是作物育种家们一个多世纪以来的主要工作目标。
在传统的育种工作中，育种家们首先得进行品种或品系间的杂交，然后从分离后代中通过表型观察选择理想的重组基因型。
这是个耗时费力的过程，其中难度最大，也是最关键的环节是选择。
一方面，有些重要性状如抗性、品质等的表型观测十分困难；
另一方面，大多数重要的性状都是数量性状，易受环境影响，使选择的准确性不高。
当孟德尔和摩尔根建立基因学说之后，育种家们就希望能变表型选择为基因型选择。
但由于受到对基因本质的认识不足及实验技术所限，直到1986年第一张作物（番茄）的RFLP图谱问世，才使这种设想成为可能。
Bernatzky和Tanksley发表的这张番茄RFLP图谱虽然仅含57个DNA标记座位，但他们的这一开创性工作不仅使育种家们看到了期待已久的希望，而且使DNA标记的研究立即成了一个非常活跃的领域。
特别是随着RAPD（Williamsetal.,1990）、SSR（Akkayaetal.,1992）、AFLP（Vosetal,1995）等基于PCR的DNA标记技术的出现，这方面的研究更是日新月异。
最近在网上查询含有分子标记（molecularmarker）关键词的论文，从1994年至2019年，每年都有4000多篇。
有了DNA标记技术，半个多世纪前Sax（1923）以及后来的Thoday（1961）提出的在育种中对复杂性状进行标记辅助选择（MAS）的设想正在成为现实。
我国DNA标记在作物育种上应用的研究工作发展也很快，特别是“863”计划生物领域在“九五”计划期间将DNA标记辅助育种作为一个专题组织攻关之后，在水稻、小麦、玉米、大豆、油菜等主要作物取得了一系列的重要进展，鉴定了一批与重要性状紧密连锁的DNA标记，通过标记辅助选择育成了一批有价值的种质，并且已开展了标记辅助基因聚合的工作。
为了将DNA标记辅助育种这一新技术介绍给广大从事作物遗传育种研究工作的同行，我们编著了此书。
全书共分六章。
为了突出重点，本书侧重于对分子标记辅助育种的基本原理和方法的介绍，而不涉及一些技术上的细节问题。
因此，对有关的一些分子生物学技术（如Southern杂交、PCR、DNA克隆等）和各种DNA标记分析的具体实验步骤，本书均不作详细介绍。
对于这些内容，读者可查阅有关的实验手册。
显而易见，DNA标记辅助育种的重点应该是标记辅助选择。
本书用了较大的篇幅介绍了DNA标记技术，因为这是基础，要用标记进行辅助选择，首先得获得标记。
分子连锁图谱的构建也是一项非常重要的基础工作，有了图谱不仅有利于新的标记的鉴定，而且更有助于辅助育种。
DNA标记的应用，除了辅助选择育种外，还有非常广阔的领域，例如，有了DNA标记图谱，可以根据图谱进行基因克隆（即图位克隆）；
应用DNA标记可以对植物遗传多样性及亲缘关系进行研究，鉴定新的种质资源及种子纯度等等。
本书从构思到完稿历尽一年有余。
由于作者水平所限，错误之处在所难免，诚望读者批评指正。
陶文静、东方阳、牛永春、翁跃进等先生参与了前期编著过程，对本书的成稿作出了贡献，宛煜嵩先生为本书的资料收集、文字和图表处理做了大量的工作。
在此，谨向他们表示衷心的感谢。
第一章遗传标记概述
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。
在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。
在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。
遗传标记可以帮助人们更好地研究生物的遗传与变异规律。
在遗传学研究中遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。
在作物育种中通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。
在现代分子育种研究中，遗传标记的应用已成为基因定位和辅助选择的主要手段。
纵观遗传学的发展历史，每一种新型遗传标记的发现，都大大推进了遗传学的发展。
第一节遗传标记的发展
19世纪后半叶，孟德尔（G.Ｊ.Mendel）以豌豆为材料，利用七对外部形态特征差异明显、易于识别的相对性状，对杂种后代的不同个体依性状表现进行归类分析，提出了“遗传因子”假说，并发现了生物遗传的分离规律和独立分配规律，即著名的孟德尔定律。
1910年，摩尔根（T.H.Morgan）在哥伦比亚大学的实验室发现一种奇特的果蝇，它的眼色不是野生型的红色而是白色，摩尔根用白眼雄蝇与野生型杂交，发现在F1代中白眼为隐性性状，在F2代中红眼与白眼的遗传符合孟德尔分离规律。
但是在按雌雄性别分别记数时发现了异常现象，雌蝇全部为红眼，雄蝇中一半为红眼一半为白眼。
由此发现决定眼色的基因与决定性别的基因是连锁遗传的，从而产生了著名的摩尔根遗传学说。
果蝇白眼遗传标记的发现成为近代遗传学研究的一个里程碑。
1913年，A.H.Sturtevant通过连锁遗传分析成功地在果蝇的X染色体上定位了5个基因，从此确定了遗传学的染色体理论和遗传作图的基本原理。
1910年以后，摩尔根将孟德尔“遗传因子”的行为与染色体的行为结合起来进行研究，证实了“遗传因子”是染色体上占有一定位置的实体，由此导致了细胞遗传学的诞生。
通过对不同物种染色体形态、数目和结构的研究，发现各种非整倍体、染色体结构变异以及各种异形染色体等都有其特定的细胞学特征，可以作为一种遗传标记来测定基因所在的染色体及其相对位置，或通过染色体代换等遗传操作进行基因定位。
这种能明确显示遗传多态性的细胞学特征，通称为细胞学标记。
1941年，美国遗传学家G.W.Beadle和生化学家E.L.Tatum通过研究红色面包霉的生化突变型，对一系列营养缺陷型进行遗传分析，提出了“一个基因一个酶”的假说，创立了生化遗传学。
50年代许多科学家发现同一种酶可具有多种不同的形式。
同时由于淀粉凝胶电泳技术的发展和组织化学染色剂的使用，使这种酶的多种形式成为肉眼可辩的带型——酶谱。
1959年，C.L.Markert和F.Moller根据对几种动物乳糖脱氢酶的多种形式的研究，提出了用同工酶（isozyme）一词来描述具有同一底物专一性的不同分子形式的酶，并证实了同工酶具有组织、发育及物种的特异性。
通过同工酶的电泳谱带可以清楚地识别同工酶的基因型，因此可以作为一种遗传标记加以利用，并且可以将编码酶的基因通过遗传分析定位在染色体上。
同工酶标记是建立在生化遗传学基础上的，所以又称为生化标记或蛋白质标记。
蛋白质标记是一种分子标记，但仍是以基因表达的结果（表现型）为基础的，是对基因的间接反映。
1953年，J.D.Watson和F.H.C.Crick提出了DNA分子结构的双螺旋模型，圆满地解释了DNA就是基因的有机化学实体，宣布了分子遗传学时代的到来。
现代基因概念的发展使直接利用DNA分子中核苷酸序列的变异作为遗传标记成为可能。
1980年，人类遗传学家D.R.L.Botstein等首先提出了DNA限制性片段长度多态性（RFLP）可以作为遗传标记的思想，开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。
RFLP标记的诞生大大加速了各种生物遗传图谱的建立和发展，同时也提高了基因定位的精度和速度。
1985年，DNA多聚酶链式反应（PCR）技术的诞生，使直接体外扩增DNA以检测其多态性成为可能。
1990年，J.G.K.Williams等和J.Welsh等两个研究小组应用PCR技术同时发展了一种新的RAPD分子标记。
随后，基于PCR技术的新型分子标记不断涌现，使得DNA标记走向商业化、实用化。
由形态标记向分子标记逐步发展的过程，体现了人类对于基因由现象到本质的认识发展过程。
在这一过程中，传统的形态标记和细胞学标记始终是遗传标记发展的基础，而蛋白质标记和DNA标记则是遗传学、生物化学和分子生物学的发展导致遗传标记发展的必然结果。
随着科学技术的不断进步，新型的分子标记还将不断涌现，新近发展的基于DNA测序和DNA芯片技术的SNP标记已为DNA标记技术的发展展示了美好的前景。
第二节遗传标记的种类
一、形态标记
形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。
典型的形态标记用肉眼即可识别和观察。
广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状如生理特性、生殖特性、抗病虫性等。
由自发突变或物理化学诱变均可获得具有特定形态特征的遗传标记材料。
例如在组织培养及诱变育种过程中经常出现的大量变异材料，其中不乏在形态特征或生理特性上具有特殊表型的个体，经过选择，就可获得稳定遗传的形态标记材料。
形态标记材料多数仅带有一个标记基因，但有的则带有多个标记基因。
后者用于基因连锁分析时，可同时分析几个标记性状。
形态标记材料在遗传研究和作物育种上都有重要的应用价值，因此对形态标记材料的收集、保存和利用历来受到各国研究者的重视。
在水稻中，目前已有的形态标记材料，大多是经过精心选育获得的。
国际水稻所和日本系统地收集了大量的形态标记材料，并作为重要的种质资源加以保存。
在水稻中已有多达300多个形态标记材料。
在番茄中已发现的形态标记也有300多种，其中苗期无花色素标记与抗烟草花叶病毒病的Tm-2基因连锁，叶状腺的大小与抗桃霉病基因连锁。
在大豆中也积累了大量的形态标记材料，其中部分标记基因已定位在相应的连锁群上（表1.1）。
形态标记基因的染色体定位最初是通过经典的二点、三点测验进行的。
通过判断不同性状间的遗传是否符合独立分配规律，来确定控制这些性状的基因是否连锁。
采用这种方法把相互连锁在一起的基因定为一个连锁群，并与染色体相对应，以性状间重组率作为这些基因在染色体上的相对距离，并确定其毗邻关系。
1910年，摩尔根领导的实验室根据对果蝇六个形态性状的分析，发现了连锁遗传现象，并根据研究性状与形态标记的连锁关系，构建了生物中第一张遗传连锁图，开创了利用已知染色体相对位置的标记基因定位未知基因的先例。
1928年，赵莲芳根据8个水稻品种的杂交资料，研究了茎、叶和颖花等器官的颜色、护颖长度、谷粒外形等12种性状的遗传，由其中9个基因的相互关系，确定了水稻的三个连锁群。
借助于这种方法在一些栽培物种中确定了许多质量性状基因的连锁关系及其在染色体上的相对位置，并绘制出较为完整的遗传连锁图谱。
以形态标记为基础的连锁群的建立为生理、生化性状的遗传研究奠定了基础。
由于形态标记数量少、可鉴别标记基因有限，因而难以建立饱和的遗传图谱。
另外，许多形态标记还受环境、生育期等因素的影响，使形态标记在植物育种中的应用受到一些限制。
表1.1大豆部分形态标记性状及标记基因（ShoemakerandOlson1993）
标记性状
标记基因（括号内数字表示所在连锁群）
色素
花色
W1，w1（8）
茸毛色
T，t
（1）
荚色
L1，l1（5）；
L2，l2
种皮
G，g（3）
种脐
R，r-m
（2）；
I，i-i，I-k，i（7）
双色
K1；
K2；
K3
子叶色
D1（3）；
D2；
Cyt-G，Y3
叶
小叶数目
L-f1，l-f2
叶形
ln（4）；
Lo，lo；
l-w1，l-w2；
l-b1,l-b2；
落叶性
A
叶绿素缺失
V1；
y3；
y4；
…y20
茸毛类型
Pa1，pa1；
Pa2，pa2；
P1，p1
（2）；
P2，p2（4）；
Pb，pb（14）；
Pc，pc；
Pd1，pd2；
Ps，ps
茎
扁化茎
f（11）
节间长度
S，s
短叶柄
Lps，lps
矮杆
df2（6）；
df3；
df4；
df5
（1）
花
花序长短
Se，se
开花和成熟
E1，e1
（1）；
E2，e2；
E3，e3；
E4，e4；
E5，e5
无限结荚习性
Dt1，dt1（5）；
Dt2，dt2
种子
种皮健全度
De，de
种皮泥膜
B1；
B2；
B3
根
根部荧光
fr1（12）；
fr2；
fr4；
Fr3
根瘤菌反应
rj1（11）；
Rj2；
Rj3；
Rj4
雄性不育
染色体联会突变
st2；
st3；
st4；
st5（8）
花药开裂不良
Ft
花丝伸长不良
fs1；
fs2
雄性不育突变体
P2（4）；
ms1（8）；
ms2；
ms3；
ms4；
ms5；
ms6（8）
抗病性
大豆灰斑病
Rcs1；
Rcs2
大豆霜霉病
Rpm
白粉病
Rmd
大豆疫根腐病
Rps（10）
大豆锈病
Rpp1；
Rpp2；
Rpp3
细菌性斑点病
Rpg1
细菌性斑疹病
Rxp
大豆花叶病毒病
Rsv1（13）；
Rsv2
大豆孢囊线虫病
rhg1；
rhg2；
rhg3；
Rhg4；
二、细胞学标记
细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。
染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。
染色体结构特征包括染色体的核型和带型。
核型特征是指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无等，由此可以反映染色体的缺失、重复、倒位和易位等遗传变异；
带型特征是指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，由此可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异。
染色体数量特征是指细胞中染色体数目的多少，染色体数量上的遗传多态性包括整倍性和非整倍性的变异，前者如多倍体，后者如缺体、单体、三体、端着丝点染色体等非整倍体。
用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料进行杂交，其后代常导致特定染色体上的基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可以测定基因所在的染色体及其相对位置。
因此，染色体结构和数目的特征可以作为一种遗传标记。
在玉米中利用B-A易位系，水稻中利用易位系，小麦中利用端着丝点染色体，大麦中利用端着丝点三体，棉花中利用易位和单体等非整倍体，番茄中利用各种三体，烟草中利用单体，已成功地将许多质量性状基因定位于染色体上，并建立了相应的连锁群。
染色体结构和数量变异常具有相应的形态学特征，在多倍体植物中广泛用于基因定位研究。
在小麦中，利用每条染色体的模式图、C-分带的带型、缺失断点的位置及分子标记在缺失间隔区的定位，构建了整个小麦基因组的物理图谱。
由于染色体结构和数量变异常具有相应的形态特征，因此，培育这样的细胞学标记材料，可以在杂种后代中直接对相应的形态标记进行选择，不必进行染色体鉴定就可确定其细胞学特征，从而提高细胞学标记的利用效率。
表1.2给出了二倍体籼稻品种IR36的12条染色体的初级三体的形态特征。
根据这些形态特征，在一般情况下可将这些初级三体与IR36区别开来。
表1.2水稻IR36初级三体的形态特征（Khushetal.1984）
染色体
三体名称
特征
1
三体1（草状）
生长缓慢，高度不育，籽粒较细长且稍呈三角形，叶窄，与草相似
2
三体2（矮生）
小穗短，护颖较长，自交高度不育，叶片短且基部附近常扭曲
3
三体4（不育）
植株最矮，叶片短厚呈革质，中脉凸出，穗伸出不完全，自交完全不育
4
三体12（高秆）
植株最高，叶片下垂，叶舌长，育性正常
5
三体5（叶片扭曲）
叶片短且扭曲，有密生茸毛，穗短，小穗着生紧密，结实率高
6
三体3（有芒）
籽粒有芒，叶片厚而半卷，叶舌长，自交高度不育
7
三体7（窄叶）
叶片窄而半卷，穗稍疏松，不完全伸出，部分可育
8
三体8（卷叶）
叶片窄卷，叶舌短，籽粒短而粗，部分可育
9
三体9（粗壮）
叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大，百粒重最高
10
三体10（短粒）
叶舌有毛，叶片直立，育性正常
11
三体11（拟正常）
形态与二倍体姊妹系无法区别，育性正常，需作细胞学鉴定
12
三体6（丛生）
外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高
细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力物力进行培养选择。
有些物种对染色体结构和数目的变异的耐受性较差，难以获得相应的标记材料。
某些物种虽然已有细胞学标记材料，但这些标记常常伴有对生物有害的表型效应，或有时观察和鉴定比较困难，从而限制了细胞学标记的应用。
三、蛋白质标记
许多生物大分子或生物化合物都具有作为遗传标记的潜力。
酚类化合物、黄酮类化合物、花色素苷及糖苷类分子曾被用作为分子标记（Mckee1973）。
但由于分离和检测这些分子的技术和手段通常比较复杂，而且费时费钱，使之很难适合于大群体的常规检测，因此这类生化物质作为遗传标记是不理想的。
与此相反，许多蛋白质分子分析简单快捷，是有用且可靠的遗传标记。
用作遗传标记的蛋白质通常可分为酶蛋白质和非酶蛋白质二种。
在非酶蛋白质中，用得较多的是种子贮藏蛋白，这些蛋白质可以通过一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分析，根据电泳显示的蛋白质谱带或点，确定其分子结构和组成的差异。
种子贮藏蛋白在小麦、大麦、玉米、水稻等作物上的研究工作比较深入，如小麦种子贮藏蛋白中醇溶蛋白和谷蛋白约占蛋白质总量的90%，对其遗传分析表明，它们是极为重要的生化遗传指标，并已被广泛地应用于小麦的遗传学研究。
酶蛋白质通常利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色来检测，根据电泳谱带的不同来显示酶蛋白在遗传上的多态性。
蛋白质的多态性，可能是由于基因编码的氨基酸序列的差异引起的，也可能是由于蛋白质后加工的不同引起的，如糖基化能导致蛋白质分子量的变化。
酶作为遗传标记是在Markert和Moller（1959）提出了同工酶的概念后迅速发展起来的。
同工酶是指具有相同催化功能而结构及理化性质又不同的一类酶，其结构的差异来源于基因类型的差异，因此并不一定是同一基因的产物。
每一个酶的不同电泳酶谱表现型可能是由于不同的基因座引起的，也可能是同一基因座上的不同的等位基因引起的。
为了易于区别，又将后一类同工酶称为等位酶（Allozymes）。
由于等位基因的差异，等位酶在氨基酸组成上或多或少也有差异。
同工酶不但已被用来标记某些重要的质量性状，如番茄的线虫病抗性，而且还用于标记复杂的数量性状，如种子大小、产量等。
编码同工酶的基因可以通过遗传分析定位于染色体或连锁群上。
在一些重要农作物中，如水稻、大豆等，已定位了许多同工酶基因（表1.3,表1.4）。
蛋白质是基因表达的产物，与形态性状、细胞学特征相比，数量上更丰富，受环境影响更小，能更好地反映遗传多态性，因此蛋白质标记是一种较好的遗传标记，已被广泛应用于物种起源和进化研究、种质鉴定、分类和抗病性筛选等领域。
但蛋白质标记仍然存在诸多不足，如每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术；
某些酶的活性具有发育和组织特异性；
局限于反映基因组编码区的表达信息等。
最关键的不足是其标记的数量还比较有限。
虽然至今已经发展了57种酶系统
升级会员 