彗星实验SCGE和微核试验在土壤生态毒理学中的应用及其进展.docx

彗星实验SCGE和微核试验在土壤生态毒理学中的应用及其进展.docx

《彗星实验SCGE和微核试验在土壤生态毒理学中的应用及其进展.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《彗星实验SCGE和微核试验在土壤生态毒理学中的应用及其进展.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

彗星实验SCGE和微核试验在土壤生态毒理学中的应用及其进展

彗星实验（SCGE和微核试验

在土壤生态毒理学中的应用及其进展

摘要:

单细胞凝胶电泳技术又称为彗星实验,是最近几年发展起来的一种快速、简单、灵敏、可靠的检测细胞核DNA损伤的技术。

目前采用的彗星实验有多种,可以检测诸如DNA双链断裂、单链断裂、碱不稳定位点等多种类型的DNA损伤。

碱性彗星实验因其高灵敏度而被广泛采用。

目前彗星实验广泛应用于各个研究领域,近年来开始用于环境污染的基因毒性研究和生物监测,并取得了迅速发展。

微核试验是一种以染色体断裂及纺锤丝损伤等为测试终点的监测方法,有毒物质造成的微核形成,作用时间是细胞分裂期间的DNA和染色体复制合成过程中。

因此,微核试验在对外来化合物（如药品、食品添加剂、农药、化妆品、环境污染物等遗传毒性检测方面,得到了广泛应用。

关键词:

彗星实验;微核试验;多环芳烃;土壤吸附

1彗星实验及其进展

1.1引言

环境污染对生物遗传物质的影响已经成为人们关心的环境问题之一,一些化学物质能够直接或间接作用于生物体DNA,干扰或破坏DNA的复制过程,引起DNA的损伤,进而引发严重后果。

过去大量采用Allium试验、染色体断裂（CA、微核试验（MCN等研究手段研究化学物质对植物DNA的损伤,但是这些方法都是在大量实验的基础上建立起来的,工作量大且耗时长,不利于广泛采用[1]。

单细胞凝胶电泳技术（singlecellgelelec-trophoresis,SCGE又称为彗星试验（cometassay,是最近几年发展起来的一种方法,可以在细胞水平上检验真核细胞DNA的损伤与修复。

植物或动物的细胞或细胞核分离后,与低熔点琼脂糖混合,铺于显微镜载玻片上电泳后,根据DNA在琼脂糖中的迁移来研究DNA损伤的程度。

因为其具有简单、快速、灵敏的特点,而广泛应用于毒理学、生物学、医学、环境生物监测等领域[2]。

1.2发展

SCGE是在核沉淀和光环测试等检测方法基础上发展起来的。

1978年,Rydberg等第1次直接检测DNA损伤的程度,把单细胞包埋于凝胶中,在碱性条件下使其部分解旋,中和后以吖啶橙染色,用光度计测量红色荧光（代表单链DNA和绿色荧光（代表双链DNA的比例来表示DNA损伤的程度。

为了提高实验灵敏度,1984年Ostling等[3]采用微电泳技术,检测射线对细胞的伤害。

在他们的实验中,将细胞固定于载玻片的凝胶上,用去污剂（SDS和高浓度盐溶液使其裂解,自由DNA在中性条件下电泳,电泳结束后以荧光染料（EB染色,在荧光显微镜下观察DNA的伤害程度。

该方法只能检测双链DNA片段,不能检测单链DNA片段[4]。

单细胞凝胶电泳自产生后就处在不断发展和完善中,以适应不同的实验需要。

Singh等[5]于1988年首先提出碱性彗星实验,用于研究X射线和过氧化氢所造成的DNA伤害,检测的敏感性大大提高。

目前我们所说的单细胞凝胶电泳技术（SCGE就是指该方法。

其后不久,Olive等[6]开始了中性电泳技术和半碱性电泳技术,即细胞经碱解处理后在中性或半碱性（pH12~13条件下电泳。

根据实验所采用的电泳胶板的不同,单细胞凝胶电泳可分为单层凝胶、双层凝胶和三层凝胶电泳技术。

现在最常用的是采用三层凝胶的碱性单细胞凝胶电泳,简单地讲,就是使细三层琼脂糖的中间层,形成类似“三明治”的结构。

1.3实验原理

彗星实验中,镶嵌于琼脂糖中的细胞核经过碱性溶液处理,DNA解螺旋且变性为单链,在电场力的作用下DNA因带负电而向阳极移动,分子量小的DNA片断移动速度相对较快,而细胞核移动相对较慢,形成类似彗星状的图像,因此该实验被称为“彗星实验”。

DNA受到的伤害愈严重,产生的断链和碱易变性片段愈多,且DNA片断愈小,在相同条件下DNA迁移量愈多,迁移的距离愈长。

因此,DNA迁移的距离（拖尾长度和拖尾部分DNA的含量（尾部荧光强度,可以作为细胞核损伤的表征参数。

通过测定DNA迁移长度或迁移部分的光密度（代表拖尾部分DNA的含量可以定量DNA的损伤程度,确定外界作用因素和DNA损伤之间的“剂量-效应”关系[7][8]。

1.4实验方法

目前采用的多种彗星实验的基本原则和实验操作都类似,主要包括单细胞悬浮液的获得、电泳胶板制备、细胞裂解、DNA变性解旋、电泳、中和、染色和观察等步骤。

从理论上讲SCGE技术适合于一切真核细胞,样品细胞需要量少,细胞可以是培养的细胞系或体细胞组织分离的

细胞,目前已经用过的细胞有人体淋巴细胞、表皮细胞、血细胞、成纤维细胞、睾丸细胞、肿瘤细胞、动物肝细胞、血细胞、植物的根细胞和叶片以及酵母细胞等[2]。

前人的研究中根据细胞来源和种类的不同,所采用的制备方法也不完全相同,但是无论采用什么方法,都要确保在细胞分离和制备过程中不要产生额外的DNA伤害或修复。

酶处理方法是获得植物原生质体或细胞核最常用方法之一,将蚕豆根尖以蒸馏水冲洗干净后以剪刀剪碎放入小离心管,加入2%的纤维素酶和果胶酶混合液,于28℃处理3h[9],获得细胞核的悬浮液并用于彗星实验.也可采用机械分离方法分离植物细胞核[10]:

植物组织放入预冷的培养皿中,冰上冷冻10min,加入一定体积缓冲液,机械分离叶片细胞核,以缓冲液充分冲洗叶片使细胞核游离,并倾斜培养皿使细胞核聚集,吸取30μL细胞核的悬浮液加入一定的溴化乙锭染色后于荧光显微镜下观察或进行彗星实验。

胶片制备即是将获得的细胞悬浮液与低熔点琼脂糖混合并铺于载玻片,这是SCGE技术中最关键的步骤。

三层琼脂糖的“三明治”式结构是目前最常用的实验方法,即在按照一定顺序在显微镜载玻片上铺三层琼脂糖,使低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液的混合物夹在中间。

有人推荐采用磨砂的载玻片,以增加低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液与载玻片间的结合力[11]。

在三层琼脂糖的“三明治”式结构中,第1层为正常熔点的琼脂糖（NMA层,它的作用是使第2层和第3层琼脂糖牢固地附着于载玻片上。

细胞裂解的具体作用是使细胞膜、核膜和其它的生物膜受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA及其它的成分扩散并通过凝胶进入裂解液,只有DNA保留在原来的位置[8]。

细胞裂解的时间对实验结果也有很大的影响。

一般来讲,裂解时间越长,慧尾也越长,但如裂解时间过长,会因慧尾太长,光密度过小,而看不到慧尾。

在进行电泳前要先使细胞核中的DNA变性解旋,即将玻片浸没于电泳液中放置一定时间。

碱性彗星实验中采用的电泳液成分是1mmol·L-1Na2EDTA,300mmol·L-1NaOH。

解旋时间的长短取决于细胞的类型和DNA损伤的程度和检测目的。

中性电泳中为了使DNA和结合的蛋白质分开,需要1h以上的时间,碱性电泳一般需要几十分钟的时间。

解旋时间的长短和中慧尾的长度[12]。

检测的灵敏度也有一定的关系。

提高解旋时间,一方面提高了检测的灵敏度,但也增加了对照。

电泳结束后,以Tris·HCl（pH7.5中和玻片,再以无水乙醇浸埋一定时间,吸去乙醇后晾干或室温下过夜。

中和时间的长短对实验结果也有很大的影响。

中和时间增加,能降低观察时背景光强度[7]。

制备好的玻片以荧光染料染色后采用荧光显微镜进行观察。

一般根据自己的仪器设备和研究的需要选择合适的荧光染料,常用的染料有溴化乙锭,吖啶橙和DAPI和YOYO21等。

观察常用的显微镜放大倍数一般为160~400倍,要根据细胞的类型和大小选择合适的放大倍数。

利用显微镜上的标尺虽然可以测量DNA迁移的长度,但是不能测量慧尾中DNA的含量,所以其使用上有一定的限制。

近年来发展的一些图像分析系统可以有效地解决这些问题,如英国的KIAS系统[11]。

1.5SCGE在土壤生态毒理学中的应用

近年来,在工农业生产实践中,大量的污染物质进入了土壤,通过多种途径影响环境,并最终影响人类的身体健康。

早期关于土壤毒理学的研究多是通过测定土壤中污染物质的浓度来表现的,但是因为土壤本身组成的复杂性,单纯用污染物质的浓度是很难代表其潜在的毒性,只有生物毒性评价的结果可以提供复杂条件下多种污染物质的综合毒性[13]。

早期土壤生态毒理学常采用植物种子发芽率、根伸长和蚯蚓毒性等,这些指标虽能综合反映土壤的污染状况,但敏感性较低,检测的是动植物个体对污染物的反映,受个体差异和环境（尤其是温度影响较大。

SCGE从细胞水平阐述污染物对环境的影响,敏感性很高,已广泛应用于医学、环境监测等研究领域中,用于检测物质对DNA的损伤,但在环境监测中,主要是用于水环境的监测,很少应用到土壤毒理研究中,而且目前研究多是采用溶液或土壤浸提液处理动物细胞或人体细胞。

植物是生态环境的重要组成部分,近年来有研究者将植物用于SCGE,拓展了SCGE的研究对象。

Gichner等[10]以烟草为材料研究了电离辐射和烷化剂的基因毒性,结果表明电离辐射和烷化剂都可以引起烟草DNA的双链和单链断裂,这些断裂在4d后方可修复。

Moretti等[14]以人体血液外围淋巴细胞为材料,采用姊妹染色体交换、微核试验和彗星实验研究豆田除草剂特丁净的基因毒性。

姊妹染色体交换、微核试验和彗星实验结果一致,都表明与S9混合后特丁净不引起DNA的伤害,但不与S9混合则引起细胞DNA的伤害。

Ribas等[15]用彗星实验方法研究了甲草胺、莠去津、百草枯、氟乐灵等除草剂引起的DNA伤害。

研究结果表明,彗星实验可以有效地检测除草剂的基因毒性,所有除草剂处理中都引起细胞拖尾的增长;这些除草剂都具有基因毒性,代谢过程影响除草剂本身的基因毒性。

1996年Koppen第一次报道了利用植物为实验材料进行彗星实验[16]。

植物毒性评价系统是进行环境污染原位监测的最好方法之一[10],利用植物彗星实验可以进行环境致突变物的检测,而且植物彗星实验和动物细胞彗星实验一样可靠,所以有必要进一步拓展植物彗星实验的研究,建立环境污染引起植物DNA损伤的监测系统,及时有效地进行环境污染风险评价。

近年来植物彗星实验有了较大发展[1][2][17],但并非所有植物都可以应用于彗星实验。

2005年林爱军等[19]应用彗星实验研究了镉对小麦叶片DNA的伤害。

2006年林爱军等[18]利用不同植物进行DNA损伤彗星实验,结果得出蚕豆、菠菜、洋葱、菜豆、大蒜等植物的根尖和叶片都可以应用于植物彗星实验,但利用水稻组织进行彗星试实验并没有获得明显的彗星图像。

1.6SCGE的展望和发展趋势

单细胞凝胶电泳是一种可以检测细胞水平上基因伤害程度的手段,具有敏感、简单、快速的优点,已经取得了广泛的应用。

因细胞的种类不同、所处的阶段不同,其敏感性和修复能力不同,在操作中要考虑多种因素的影响,以使实验结果更具可比性。

今后对“彗星”的形成机制需要进一步研究。

2微核试验及其研究进展

2微核试验及其进展

2.1微核试验

微核是指位于细胞浆中独立于主核的核小体,主要由外界损害因素（生物的、物理的、化学的作用细胞后,导致细胞染色体丢失或断裂,从而在胞浆中形成1个或数个小核[20]。

微核试验是一种以染色体断裂及纺锤丝损伤等为测试终点的监测方法,有毒物质造成的微核形成,作用时间是细胞分裂期间的DNA和染色体复制合成过程中。

因此,微核试验在对外来化合物（如药品、食品添加剂、农药、化妆品、环境污染物等遗传毒性检测方面,得到了广泛应用。

同时,该方法在职业暴露人群遗传损害监测和现场生态环境检测方面,也得到了大量的应用。

微核试验最大的优点是经济、简单、快速,而国内外大量的对比试验研究,比较一致的看法是该方法在敏感性、特异性和准确性方面,与经典的染色体畸变分析方法基本相当[21]。

因而,特别适合作为大量化合物和现场人群初筛的实验方法。

微核试验创建于20世纪70年代中期（1973~1975[22][23]目前许多国家和国际组织,已将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理安全性评价的必做试验。

近年来,随着分子生物学技术的迅速发展和渗透到微核研究中,大大拓展了微核试验的检测和应用范围,已发展成为能同时检测染色体断裂、丢失、分裂延迟、不分离、DNA损伤修复障碍