海藻糖和透明质酸对膜脂双层的保护及其作用机制.docx

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海藻糖和透明质酸对膜脂双层的保护及其作用机制

海藻糖和透明质酸对膜脂双层的

保护及其作用机制

１，２２，３４张玉华，籍保平＊，凌沛学，孟　一

（１．山东师范大学生命科学学院，山东　济南　　　　　　　２５００１４；２．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京　　　　　　　１０００８３；３．山东省生物药物研究院博士后科研工作站，山东　济南　　　　　　　　２５０１０８；４．山东商业职业技术学院，山东　济南　　　　　　　　　２５００１３）摘　　　要：

根据冻干脂质体药物保存率、粒径变化、玻璃化温度（Ｔｇ）以及磷脂与糖类相互作用，考察海藻糖和透明质酸（ＨＡ）的保护作用及其作用机制。

冻干－再水化过程中，海藻糖、乳糖、蔗糖、ＨＡ以及海藻糖和ＨＡ复配物均能抑制脂质双层融合与药物泄漏。

ＨＡ单独使用时保护作用较低，而与海藻糖组合后作用高于两者单独使用。

成的氢键。

海藻糖和ＨＡ复配可以充分海藻糖与磷脂间存在相互作用，该作用可能是海藻糖的－ＯＨ与磷脂ＰＯ２－形

发挥两者的互补作用，即海藻糖的“水替代”作用与ＨＡ的“玻璃态”作用有机结合，因此保护效果最佳。

关键词：

海藻糖；透明质酸；膜脂双层；保护作用

Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ａｎｄ　Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ　ｏｎ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｌｉｐｉｄ　Ｂｉｌａｙｅｒ

ＺＨＡＮＧ　Ｙｕ－ｈｕａ１，２，ＪＩ　Ｂａｏ－ｐｉｎｇ２，＊，ＬＩＮＧ　Ｐｅｉ－ｘｕｅ３，ＭＥＮＧ　Ｙｉ４

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｊｉｎａｎ　　　　　　　　２５００１４，　Ｃｈｉｎａ；

２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ　　　　　　　　１０００８３，　Ｃｈｉｎａ；

３．Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｓｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ｏｆ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，　Ｊｉｎａｎ　　　　　　　２５０１０８，

Ｃｈｉｎａ；４．Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｏｍｍｅｒｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｊｉｎａｎ　　　　　　　２５００１３，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：

　Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｄｒｕｇ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ，　ｄｉａｍｅｔｅｒ　ｃｈａｎｇｅ，　ｇｌａｓｓ－ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　（Ｔｇ）　ｏｆ　ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ａｎｄ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｂｙ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ａｎｄ　ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　（ＨＡ）ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ．　Ｂｉｌａｙｅｒ　ｆｕｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｒｕｇ　ｌｅａｋａｇｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｒｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ，　ｌａｃｔｏｓｅ，　ｓｕｃｒｏｓｅ，　ＨＡ　ａｎｄ　ｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ａｎｄ　ＨＡ．　Ｔｈｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ＨＡ　ａｌｏｎｅ　ｔｏ　ｐｒｏｔｅｃｔ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｉｓ　ｌｏｗ，　ｈｏｗｅｖｅｒ，　ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅａｎｄ　ＨＡ　ｉｓ　ｍｏｒｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ａｄｄｉｔｉｖｅｓ　ｕｓｅｄ　ａｌｏｎｅ．　Ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ａｆｔｅｒ

２－ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ．　Ｔｈｉｓ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｉｓ　ｆｏｒｍｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　－ＯＨ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ａｎｄ　ＰＯ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｂｙ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ

ｂｏｎｄｉｎｇ．　Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ａｎｄ　ＨＡ　ｏｆｆｅｒ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ａｄｄｉｔｉｖｅｓ　ａｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏｇｅｔｈｅｒ．　Ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆ“　ｗａｔｅｒ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ”　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ａｎｄ“　ｇｌａｓｓｙ　ｓｔａｔｅ”　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＨＡ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：

ｔｒｅｈａｌｏｓｅ；ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ；ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｌｉｐｉｄ　ｂｉｌａｙｅｒ；ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ

中图分类号：

Ｑ７３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码：

Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号：

１００２－６６３０（２００７）０８－００４９－０７通常生物膜表面结合大量水分子，这些水分子在磷

［１］脂双层周围形成一层水化膜，水化膜对维持膜结构和

功能具有重要意义。

脱水对膜脂双层产生严重影响：

使

磷脂双层相互靠近，导致膜融合，从而引起内容物泄

［２］漏；脱水能提高磷脂的Ｔｍ［３］，脱水过程中，会发生

从液晶相至凝胶相的转变。

与此相反，干磷脂在水化

后，凝胶相又转变为液晶相。

在这两个相变过程中，

均伴随内容物泄漏；脱水过程中发生的侧向相分离也是对膜的一种损坏，在含有蛋白质的膜脂双层中，可以导致膜内蛋白质错位和非双层相的形成，使膜蛋白功能［４］丧失，内容物漏出。

虽然脱水会对膜脂双层产生严重损坏，但某些有机体，如植物种子、某些真菌和病毒的孢子、某些昆虫的幼虫等，能在几乎完全失水状态下生存几十年，一旦遇到水，它们能迅速地恢复代谢能力。

研究发现，这些有机体都含有大量的糖和糖醇，尤其是海藻糖。

人收稿日期：

２００７－０５－１６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＊通讯作者

作者简介：

张玉华（１９７３－），女，博士研究生，研究方向为功能食品。

们由此开始对糖是否对生物膜、蛋白质等具有保护作用

及其作用机制进行了广泛而深入的研究。

Ｃｒｏｗｅ等［５］

用ＰＯＰＣ（１－棕榈酰－２－油酰磷脂酰胆碱）和ＰＳ（磷脂酰丝氨酸）混合物（ＰＯＰＣ：

ＰＳ＝９：

１）制备成阿糖胞苷脂质体，测定冻干－再水化后药物保存率，结果对照组药物几乎全部泄漏，而含有少量海藻糖的脂质体药物保存率明显增加，随海藻糖浓度增加，保存率最终接近

１００％。

Ｃｒｏｗｅ等［６］

提出，有效地保护膜脂双层须满足两个条件：

降低干态磷脂的Ｔｍ，避免脱水－再水化过程中膜脂相变；抑制膜脂双层融合，避免内容物泄漏。

不同种类的糖对膜脂双层的作用机制不同，因而保护作用存在显著差异。

本研究探讨海藻糖、ＨＡ及两者复配对膜脂双层的保护作用，并与乳糖和蔗糖的作用进行比较，以期探讨其作用机制。

由于脂质体的结构与生物膜相似，因此本研究以脂质体为模型。

１材料与方法１．１

试剂

海藻糖（纯度＞９９％）　　　　日本林原商事株式会社；ＨＡ

（ＭＷ为２．０×１０６

，批号为２００４０５１６）　　　　山东福瑞达生物化工有限公司；乳糖、蔗糖、甲醇、氯仿、胆固醇（分析纯）　　　　北京试剂公司；磷脂（ｌｉｐｉｏｄ　Ｅ８０、磷脂酰胆碱＞８０％）　　　　德国Ｌｉｐｏｉｄ公司；阿霉素（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ，即盐酸多柔比星）　　　　浙江海正药业股份有限公司。

１．２

仪器

Ｒ－１２４旋转蒸发仪　　　　瑞士布奇公司；Ａｇｉｌｅｎｔ　８４５３紫外－可见分光光度计　　　　德国Ａｇｉｌｅｎｔ科技公司；ＦｒｅｅＺｏｎｅ６Ｌ真空冷冻干燥机　　　　美国Ｌａｂｃｏｎｃｏ公司；ＺｅｔａＳｉｚｅｒ３０００激光粒度分布与Ｚｅｔａ电势分析仪　　　　英国Ｍａｌｖｅｒｎ公司；ＶＣＸ－６００超声波破碎仪　　　　美国ＳＯＮＩＣＳ公司；ＤＳＣ８２２ｅ差示扫描量热仪　　　　瑞士Ｍｅｔｔｌｅｒ　Ｔｏｌｅｄｏ公司；ＮｉｃｏｌｅｔＭａｇｎａ－ＩＲ　７５０傅里叶变换红外光谱仪　　　　美国Ｎｉｃｏｌｅｔ公司。

１．３方法

１．３．１

保护剂用量及溶液配制

海藻糖、乳糖、蔗糖组，糖与胆脂（胆固醇＋磷脂）质量比均为２．５：

１；ＨＡ组，ＨＡ与胆脂质量比为

０．４：

１；海藻糖和ＨＡ复配组，两者与胆脂质量比分别为２．５：

１和０．２：

１。

保护剂溶液均用ｐＨ６．５的磷酸盐缓冲液配制，对照组用该缓冲液代替保护剂溶液。

１．３．２

脂质体的制备

取磷脂４００ｍｇ和胆固醇２００ｍｇ，用氯仿、甲醇混合液（２：

１）３０ｍｌ溶解；减压旋转蒸发除去有机溶剂，使磷脂和胆固醇混合物在圆底烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜；用ＡＤＭ、保护剂溶液２０ｍｌ水化３０ｍｉｎ；冰浴超声

破碎（功率４５０Ｗ，处理５ｓ，间歇１ｓ，共２０ｍｉｎ），得

脂质体悬液。

为避免相关成分的影响，用于红外光谱分析的样品不含阿霉素和胆固醇，且保护剂溶液均用蒸馏水配制，对照组用蒸馏水代替磷酸盐缓冲液。

１．３．３

冷冻干燥

先将脂质体混悬液冻结，再置于冷冻干燥机内干燥（真空度６．９Ｐａ，隔板温度约－５０℃）约２４ｈ，使样品中残余水分含量低于５％。

１．３．４

药物保存率

取载药脂质体混悬液１ｍｌ，用Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０进行柱层析，ｐＨ６．５的磷酸盐缓冲液洗脱，将游离阿霉素与脂质体分离，收集脂质体，用甲醇溶解脂质体并于２３４ｎｍ测定阿霉素吸光度。

冻干脂质体定量水化后再进行柱层析。

药物保存率（％）＝——处—理—后—脂—质—体—内—阿—霉—素—吸光度

处理前脂质体内阿霉素—吸—光—度

——×１００

１．３．５

脂质体粒径测定

采用ＺｅｔａＳｉｚｅｒ３０００激光粒度分布与Ｚｅｔａ电势分析仪测定，冻干脂质体再水化后测定。

１．３．６

差示扫描量热分析

取２～１０ｇ待测样品放入铝质样品盘中，另放一空盘为参照。

在氮气环境下扫描，扫描温度范围－７０～

２００℃，升温速率４℃／ｍｉｎ，氮气流量５０ｍｌ／ｍｉｎ。

Ｔｇ根

据Ｍａｕｒｙ等［７］

的方法计算。

１．３．７

傅里叶变换红外光谱测定及数据处理

干态样品测定，取干样０．５～１．０ｍｇ与无水溴化钾３００ｍｇ混合研磨压片。

脂质体悬液测定，将溶液放入液体池中，用衰减全反射法（ＭＢ－ＨＡＴＲ）扫描，结果减去水的吸收背景。

用Ｎｉｃｏｌｅｔ　Ｍａｇｎａ－ＩＲ　７５０傅里叶变换红外光谱仪进行分析，扫描范围４０００～４００ｃｍ－１，分辨率４ｃｍ－１。

１．３．８

残余水分含量分析

根据１０５℃干燥失重计算。

２结果与分析

２．１

冻干－再水化过程中海藻糖和ＨＡ对脂质体药物保

存率的影响

由图１可见，对照组冻干－再水化后脂质体中药物几乎全部泄漏。

脂质体制备过程中加入海藻糖、乳糖、蔗糖、ＨＡ和海藻糖与ＨＡ复配均能够抑制冻干－再水化后药物泄漏，其中海藻糖的效果较好，ＨＡ的作用最差，而ＨＡ与海藻糖复配效果非常显著，药物保存率高于其它各组。

２．２

海藻糖和ＨＡ用量对冻干脂质体药物保存率的影响

随着海藻糖用量的增加，冻干脂质体药物保存率显著增加。

ＨＡ用量对药物保存率影响不明显，但向海藻

１０ａ．对照组

８ｂ．海藻糖组）

（％ｃ．乳糖组６ｄ．蔗糖组保存率ｅ．ＨＡ组药物４ｆ．海藻糖＋Ｈ

Ａ组

２组别

图１　　　　糖对冻干脂质体药物保存率的影响

Fig.1Effectsofcarbohydratesonretentionofsolutesin

lyophilizedliposomes

１０

）

８（％６保存率ＨＡ／ｇ胆脂

ＨＡ／ｇ胆脂药物４ＨＡ／ｇ胆脂２ＨＡ／ｇ胆脂ＨＡ／ｇ胆脂

０

０．５

１

１．５

２

２．５

３

海藻糖／胆脂

图２　　　　海藻糖和HA用量对药物保存率的影响

Fig.2Retentionofsolutesbyliposomesfreeze-driedinpresenceofindicatedamountsoftrehalose,withadditionof

variousamountsofHA

糖与脂质体的混合物中添加ＨＡ至一定量（ＨＡ：

胆脂＝０．２：

１～０．４：

１）时，与无ＨＡ组相比，药物保存率显著提高。

２．３冻干对脂质体粒径的影响及海藻糖和ＨＡ的保护作

用

１００８０ｍ）

径（ｎ６０平均粒４０２０组别

ａ．对照组；ｂ．海藻糖组；ｃ．乳糖组；ｄ．蔗糖组；ｅ．ＨＡ组；ｆ．海藻糖＋ＨＡ组。

图３　　　　冻干前后不同糖存在时脂质体粒径

Fig.3Diameterofliposomesbeforeandafter

lyophilizationin

presenceofvariouscarbohydrates

由图３可见，无保护剂组冻干－再水化后脂质体粒径比冻干前增大了约３．５倍，这是由于失水后，膜脂双

层相互靠近，相邻脂质体融合成较大的囊泡。

添加糖

的各组冻干前后粒径变化不大，说明海藻糖、乳糖、蔗糖、ＨＡ以及海藻糖与ＨＡ复配均能抑制冻干引起的脂质双层融合。

２．４

玻璃态对脂质体融合与药物保存率的影响

为了考察玻璃态对脂质体稳定性的影响，冻干脂质体分别于１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０℃保温２ｈ，立即水化后测定粒径和药物保存率。

当保温温度低于脂质体的Ｔｇ时，平均粒径和药物保存率变化不明显。

当保温温度接近、等于或高于其Ｔｇ时，平均粒径明显增大，且药物保存率显著降低，表明脂质双层融合、药物泄漏。

粒径和药物保存率随保温温度变化趋势表明，脂质双层融合、药物泄漏均和

表１　　　　不同糖存在时冻干脂质体的Tg

Table1

Tgvaluesoflyophilizedliposomesinpresenceof

variouscarbohydrates

样品Ｔｇ（℃）

海藻糖组５１．５３乳糖组４０．５２蔗糖组３４．８５ＨＡ组９５．５２海藻糖＋ＨＡ组

７６．０６１０８００７００）

８（％６００６５００平均保存率４００粒径药物４３００（ｎｍ）

２２００１００

０Ｔｇ（℃）Ａ．海藻糖

组

１０８００８７００（％）

６００存率６５００平均４００粒径药物保４３００（ｎｍ）

２２００１００

０１０２０３０４０５０６０７０８０９０

０Ｔｇ（℃）Ｂ．海藻糖＋ＨＡ组

图４　　　　保温温度对再水化后脂质体平均粒径与药物保存率的影响Fig.4Effectsofincubationtemperatureonmeandiameterand

retentionofsolutesofrehydratedliposomespreviouslystoredfor

2hatindicatedtemperature

２．６

脂质体的Ｔｇ具有相关性。

当体系处于玻璃态时，各组

分的振动能降低，脂质体融合与药物泄漏受到抑制。

单磷脂对糖－ＯＨ红外光谱的影响

为进一步明确上述糖与磷脂间是否存在直接相互作

独添加海藻糖时体系的Ｔｇ较低，加入ＨＡ提高了体系的Ｔｇ，因此在相同温度下，海藻糖和ＨＡ复配对膜脂双层融合与药物泄漏的抑制作用高于海藻糖单独使用。

２．５

海藻糖和ＨＡ对膜脂ＰＯ２－红

外光谱的影响考察了实验各组干态磷脂ＰＯ２－不对称伸展ＩＲ，并

与水化态磷脂进行比较，结果如图５所示。

ＰＯ２－吸

收峰所对应的波数分别是：

水化态磷脂１２３５ｃｍ－１，无保护剂

组１２５０ｃｍ－１，

海藻糖组１２３０ｃｍ－１，乳糖组１２３７ｃｍ－１

，蔗糖组１２３４ｃｍ－１，ＨＡ组１２４９ｃｍ－１，海藻糖与ＨＡ复

配组１２３２ｃｍ－１。

由此可见，无保护剂组膜脂干燥脱水后，ＰＯ２－不对称伸展ＩＲ吸收峰从水化态的１２３５ｃｍ－１移

至１２５０ｃｍ－１。

早在１９７８年Ｆｏｏｋｓｏｎ等［８］

就通过ＩＲ观察到：

ＤＰＰＣ（二棕榈酰磷脂酰胆碱）极性基团周围的氢键结

合水使ＰＯ２－吸收峰向较低频率偏移。

冻干后膜脂ＰＯ２－不对称伸展吸收峰向高波数移动，是由于ＰＯ２－周围的氢

键结合水被除去，膜脂极性基团相互靠近。

海藻糖、

乳糖和蔗糖组冻干后ＰＯ２－吸

收峰基本上未发生位移，表明上述糖对ＰＯ２－的作用与水对其作用相似。

水与ＰＯ２－之间是通过氢键相互作用的，因此推测海藻糖、乳糖和蔗糖与ＰＯ２－间也存在氢键作用。

海藻糖和ＨＡ复配组与海藻糖、乳糖和蔗糖组结果相似。

ＨＡ组ＰＯ２－吸收峰峰位值与无保护剂组接近，表明ＨＡ对磷脂ＰＯ２－不对称伸展ＩＲ无影响。

Ａ

度

吸光１３００１２８０１２６０１２４０１２２０１２００

波数（ｃｍ－１）

Ｂ

度

吸光１３００１２８０１２６０１２４０１２２０１２００

波数（ｃｍ－１）

Ｃ

吸光度

１３００１２８０１２６０１２４０１２２０１２００

波数（ｃｍ－１）

Ｄ

吸光度

１３００１２８０１２６０１２４０１２２０１２００

波数（ｃｍ－１）

Ｅ

吸光度

１３００１２８０１２６０１２４０１２２０１２００

波数（ｃｍ－１）

Ｆ

吸光度

１３００１２８０１２６０１２４０１２２０１２００

波数（ｃｍ－１）

Ｇ

吸光度

１３００１２８０１２６０１２４０１２２０１２００

波数（ｃｍ－１）

Ａ．水化态脂质体；Ｂ．无保护剂组；Ｃ．海藻糖组；Ｄ．乳糖组；Ｅ．蔗糖组；

Ｆ．ＨＡ组；Ｇ．海藻糖＋ＨＡ组。

图５　　　磷脂PO2－

不对称伸展红外谱图

Fig.5Infraredspectraofphosphateasymmetric

stretch

ａ

度

吸光ｂｃ１４００

１２００１００

０

波数（ｃｍ－１）

Ａ

ａ

度

ｂ

吸光ｃ１４００

１２０

０１０

０

０

波

数（ｃｍ－１）

Ｂ

ａ

ｂ

吸光度

ｃ１４００

１２００

１

０００

波数（ｃｍ－１）

Ｃ

ａ

度

ｂ

吸光ｃ

１４００

１２００

１

０

００

波

数

（ｃｍ－１）

Ｄ

ａｂ

吸光度

ｃ

１４００１２００１０００

波数（ｃｍ－１）

Ｅ

ａ．冻干糖类；ｂ．脂质体与糖混合冻干样；ｃ．水化糖类；Ａ．海藻糖；Ｂ．乳

糖；Ｃ．蔗糖；Ｄ．ＨＡ；Ｅ．海藻糖＋ＨＡ。

图６　　　　　糖-OH平面弯曲变形红外谱图

Fig.6Infraredspectraof-OHplane-bendingdeformationsfor

carbohydrates

用，考察了磷脂对糖－ＯＨ红外光谱的影响。

将糖单独冻干样、糖与脂质体混合物冻干样以及水化态糖的－ＯＨ平面弯曲变形吸收光谱进行比较（图６），结果表明：

磷脂的存在导致干态海藻糖－ＯＨ平面弯曲吸收峰强度降低，谱带分裂减少，且与其水化态光谱相似，海藻糖

单独冻干样与上述两个光谱差异较显著。

乳糖、蔗糖和海藻糖＋ＨＡ组也得到了类似的结果。

但ＨＡ组结果与上述四组不同，磷脂存在时干态ＨＡ的－ＯＨ光谱与其单独冻干样相似，而与水化态不同。

该结果与第三章中ＰＫａｓｅ对糖－ＯＨ红外光谱影响结果一致，结合图５结果，我们推测海藻糖、乳糖和蔗糖的－ＯＨ均与磷脂的ＰＯ２－

产生氢键相互作用，ＨＡ的－ＯＨ与ＰＯ２－之间未形成氢键，但ＨＡ的存在不影响海藻糖与磷脂的相互作用。

Ｃｒｏｗｅ等［４］利用龙虾腹部肌浆网状组织为模型，探讨了

有无海藻糖存在时肌浆网状组织中ＰＯ２－红外吸收光谱，

认为脱水后海藻糖的－ＯＨ可与磷脂分子的ＰＯ２－形成氢键，代替ＰＯ２－周围失去的水分子，从而维持磷脂物理性质不变。

３

讨　　论

３．１

玻璃态对膜脂双层稳定性的影响

Ｓｕｎ等［９］

认为，玻璃体具有较高的黏度，能够降低分子的运动性，有利于抑制膜融合。

此外，糖玻璃体对脂质体的物理隔离作用也是抑制玻璃体内部脂质双层融合的一个重要因素。

同时，Ｓｕｎ等对脂质体内容物泄漏与膜融合进行了动力学研究，发现玻璃体内部脂质体融合与泄漏仍然能够发生，但进行的速度非常低。

保温实验发现，当温度接近或高于脂质体的Ｔｇ时，药物保存率降低和脂质体粒径增大非常显著，说明玻璃态是抑制脂质体融合与药物泄漏的一个重要因素。

但是，根据我们的实验结果，ＨＡ单独使用时脂质体冻干前后粒径变化不大，说明ＨＡ在一定程度上能抑制膜脂双层融合。

但冻干后ＨＡ组药物保存率较低，表明脂质双层膜融合并不是导致内容物泄漏的唯一因素，膜脂在脱水－

再水化时出现的相变也会引起内容物泄漏［１０］。

当磷脂的温度达到Ｔｍ时，由于单个磷脂囊泡受热不均匀或者形成更复杂的混合相，处于凝胶相和液晶相之间的双层膜边缘出现了短暂的损伤，结果内容物发生泄漏。

Ｃｒｏｗｅ等［３］

分别研究了海藻糖、蔗糖和右旋糖酐对

ＤＰＰＣ和ＰＣ（磷脂酰胆碱）脂质体冻干后药物保存率的影

响，结果右旋糖酐抑制ＤＰＰＣ脂质体药物泄漏的作用与海藻糖、蔗糖相当，而对ＰＣ脂质体的保护作用显著低于海藻糖和蔗糖组。

他们对此的解释是，ＤＰＰＣ为饱和磷脂，其Ｔｍ为４１℃，无论在室温还是冷冻条件下均处于凝胶相，不会发生相变，因此只要抑制冻干时膜融合就能得到稳定的ＤＰＰＣ脂质体，右旋糖酐、海藻糖和蔗糖均能形成玻璃态，从而有效地抑制ＤＰＰＣ膜融合和内容物泄漏。

ＰＣ为不饱和磷脂，Ｔｍ较低，冻干－再水化过程中易发生相变，因此对ＰＣ脂质体的保护作用包括抑制膜融合与降低Ｔｍ，右旋糖酐对其保护作用差，是由于它不能与磷脂极性基团形成氢键相互作用，因而不能降低Ｔｍ。

３．２

糖与磷脂间的相互作用对膜脂双层稳定性的影响Ｃｒｏｗｅ等［３］

利用ＩＲ测得水化ＰＣ的Ｔｍ为－５℃，冻

干后Ｔｍ上升至５５℃。

当海藻糖存在时，冻干前后其Ｔｍ不变，而加入右旋糖酐不能抑制冻干后ＰＣ的Ｔｍ升

高。

Ｃｒｏｗｅ等［１１］

认为海藻糖降低干态磷脂的Ｔｍ，是由于磷脂冻干后海藻糖的－ＯＨ和磷脂的ＰＯ２－通过氢键连接。

与冻干前相比，磷脂极性头部占据的空间不变，这样就阻止了由于失水导致的碳氢链密度增加和维持碳氢链间相互作用的范德华力增加，因此与冻干前相比Ｔｍ不变。

上述例子中，右旋糖酐不能抑制冻干后ＰＣ的Ｔｍ升高，是由于右旋糖酐为高分子化合物，空间位阻较大，因而不能与磷脂极性基团产生氢键作用。

本研究虽未观察脱水后膜脂Ｔｍ的升高以及海藻糖降低其Ｔｍ，但根据糖的－ＯＨ和磷脂的ＰＯ２－红外光谱的相互影

响，可以看出，失水后海藻糖、乳糖和蔗糖的－ＯＨ与

磷脂的ＰＯ２－之

间存在氢键相互作用，即Ｃｒｏｗｅ等［１２－１３］

提出的“水替代”假说。

海藻糖、乳糖和蔗糖的“水替代”作用使得失水后磷脂双层周围仍存在一层假定的水化膜，可以避免膜脂双层融合、相变和内容物泄漏。

本研究中海藻糖和ＨＡ复配发挥了两者的互补作用，显示了一定的优势。

海藻糖一方面与磷脂通过氢键连接发挥“水替代”作用，避免磷脂冻干－再水化过程中的相变及其导致的内容物泄漏，另一方面海藻糖能够形成玻璃态，但其Ｔｇ较低。

ＨＡ虽然不能与磷脂产生氢键相互作用，但能够提高体系的Ｔｇ，从而有效

地抑制膜融合及其导致的药物泄漏。

Ｃｒｏｗｅ等［６］

将羟乙基淀粉和葡萄糖复配得到了稳定的脂质体，也是利用两者的互补作用，即葡萄糖降低干态磷脂的Ｔｍ，羟乙基淀粉提高体系的Ｔｇ。

４

结　　论

冻干引起脂质