显微摄影基础知识Word文档格式.docx
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只要有合适的显微镜照相连接器（附有观察、取景装置），不论是生物显微镜、临床显微镜、倒置显微镜还是体视（解剖）显微镜等，都可以把适合的照相机机身或电影摄影机机身连接起来，进行观察、选视野、照相或拍电影。
（3）适合显微摄影的显微摄影装置
A.要有能够连接显微照相机附件的装置，如35mm照相机后背或大画面底片暗盒。
B.能按照摄影中需要的不同光亮条件进行光路调节。
C.能够对标本不同的面积进行测光（对30%面积的平均测光，或对1%、0.1%面积的点测光）。
D.能够把照相机附件牢固地固定在显微镜上。
E.可连接色温测定的装置。
F.ISO/ASA感光度要有广泛的选择范围。
G.要有倒易律失效补偿装置，可以进行长时间的自动曝光。
H.要能够根据标本的具体情况，进行曝光量的调节。
I.要能够进行手动曝光。
J.要能装配特殊用途的装置，如拍16mm电影或35mm胶片的定使定格摄影（在此情况下，还应有专门的曝光控制装置）。
K.控制器内要装有自动曝光锁机构
3．不同型号的显微摄影装置与其功能
显微摄影的装置种类甚多，从帧幅的大小，可分为135型、4”X5”或6”X9”型几种；
从控制系统的操作，可分为自控、半自动及全自动控制三种类型。
135型（即35mm胶片照相机）操作方便；
4”X5”或6”X9”大帧幅照片操作时则较麻烦，但它拍出照片的细微结构的清晰度则优于135型；
从控制系统来看，手控式较难掌握曝光时间；
半自动则可测出准确的曝光时间以及光源的色温，但仍不能满足多功能的要求；
高级的显微摄影系统为全自动控制，功能齐全，是研究用显微镜的理想显微摄影装置。
4．显微镜的安放与显微镜室的布置
显微镜是精密仪器，但只要正确使用，注意维护保养一般不会出现故障。
用于显微摄影的显微镜更需要注意以下几点：
（1）显微镜不要离机械设备或机器太近，也不要放置在经常有人走过的地方，以免外界的震动使底片上的图象模糊。
（2）显微镜不要靠近窗户。
因为从窗户射入的亮光影响了聚焦的准确性。
（3）放置显微镜的工作室不要太亮，否则反射光和照明的眩光透过目镜会反射到底片上感光。
（4）显微镜不要放置于有灰尘和肮脏的房间，并注意清洁显微镜。
5．适合显微镜摄影用的物镜与照相目镜
显微摄影需要有高分辨率、广视野平场的物镜。
不论哪个厂家的显微镜，在选择显微摄影用物镜时都要注意此点。
消色差物镜不适合显微摄影，它本身会引起视场图象的边缘焦点不实，而呈现模糊的现象。
这是由其本身的性能引起的。
如果改用平场消色差物镜就可得到全视场清晰而平坦的图象。
所以在显微摄影时必须选用平场消色差物镜和平场复消色差物镜。
不仅如此，显微照片的细微结构和层次的优劣，也取决于物镜的分辨率。
在进行高倍（40X）干燥系物镜的显微摄影时，最好采用带校正环物镜，因高倍干燥系物镜的成象质量与盖玻片的标准厚度有关，盖玻片的厚度不符合标准，将造成覆盖差而影响显微摄影的质量。
在暗场、投射式荧光及油显微照相时，应选用带虹彩光阑的物镜，借调节光阑的大小，达到最佳的图象对比度。
有些被检物体不能应用盖玻片，应选用无罩物镜。
另外在进行油浸荧光显微照相时，应使用无荧光油。
照相目镜的作用是为物镜的色差、象差做光学补偿，使投射到感光底片上的图象，四周与中心都尽可能在一个焦点平面上。
因此，正确选用生产厂家推荐的照相目镜，是十分重要的。
6．聚光镜的选择
聚光镜在显微摄影中的作用很大，它不仅是将光源投射来的光有效地聚焦到被检物体上，更重要的是产生与物镜相适应的光束使图象的反差和焦深处在最佳状态。
这些条件的获得，是以调节聚光镜的孔径光阑从而使聚光镜的数值孔径与所用物镜数值孔径达到对应关系。
根据使用的意图，可准备几种不同的聚光镜。
特别在使用超低倍物镜，如1X、2X和4X时，视场边缘往往发生光亮不均匀或光亮不足的缺陷，因而必须有超低倍的聚光镜与物镜组配。
二．滤色镜在显微摄影中的作用
滤色镜又称滤光镜，它在显微镜的镜检和显微照相种的作用是不可忽视的。
合理的选用滤色镜能提高图象的衬度、分辨率和增强反差；
在彩色显微照相中，能调节光源的色温。
1．滤色镜的种类与功能
滤色镜为有色玻璃（或有色胶摸）制成的透明镜片。
滤色镜有各种各样，种类很多，性能不一。
所以，很好地了解性能，选用符合照相目的的滤色镜，是拍好照片的关键。
（1）色温转换滤色镜 这是在拍摄彩色照片时，为了使显微镜光源的色温与胶片本身要求的色温相符合（色温转换）而使用的滤色镜。
灯光型彩色片选用LBT滤色镜，日光型彩色片选用LBD-2滤色镜。
如果色温转换得不合适，就不能很好地使彩色还原。
（2）中灰ND滤色镜（NeutralDensityFilter） 这是一种不改变色温而减少照明的光量，并能使曝光时间延长的滤色镜。
ND25仅允许25%的光量透过，阻止75%的光量通过；
ND50则允许50%的光量透过，阻止50%的光量通过。
（3）反差滤色镜（绿和橙黄色） 这是拍摄黑白照片专用的。
它是为了使标本的色调与照片上的色调相一致，起着有时加强反差，有时减弱反差的作用。
通常用绿滤色镜（G530）或橙滤色镜（O560）为最多。
（4）彩色补偿滤色镜（ColorCompensatingFilter） 这是为了解决彩色照相拍摄标本颜色或背景颜色不正常时作为颜色补偿用的一种滤色镜。
（5）铷镨滤色镜（OLYMPUS用FF表示） 这是在拍摄彩色照片时，为了加深红颜色而使用的一种滤色镜
（6）吸热滤色镜 这是在拍摄生物标本时，吸收来自光源的红外线，为避免因热辐射而使生物标本（如活细胞等）死亡而使用的一种滤色镜。
滤色镜本身带有一种很浅的颜色，所以在拍摄彩色照片时颜色会发生变化，需要加彩色补偿滤色镜（CC10Y或CC10M）。
2．光源的色温及色温平衡滤色镜
光源的色温，即光源的放射能，它是由波长来表现的，也就是由光的颜色来表现的。
色温以“°
K”作单位，是以标准黑体的绝对温度为起点，每升高1°
C为1°
K。
这里必须明确，在照相上光源色温的应用是指光线中所含颜色的成分，而不是指光线中冷热的温度。
日光的色温为5500~6000°
K，即指日光与标准黑体在5500~6000绝对温度时发出的光一样。
彩色胶片在很多情况下，是以日光下进行摄影作为前提而制造出来的。
换句话说，如果不与日光相同的色温进行彩色进行彩色摄影，则就不能得到正确的颜色还原。
显微镜的照明光源多为低压钨丝灯和卤素灯，前者的色温为2600~3000°
K，后者为3000~3400°
K左右，随电压的升高，色温亦随之升高。
由于钨丝灯与卤素灯的色温与日光相差很多，因此，显微摄影时必须设法把灯光的色温转换成日光的色温。
通常使用两种方法：
（1）选择功率高的照明光源如12V100W的卤素灯，以获得较接近日光的色温。
（2）使用滤色镜改变光源的色温，用于此目的的滤色镜叫做色温转换滤色镜。
请注意，应用色温转换滤色镜，在显微摄影中非常重要。
如果需要知道色温的确切数值，可通过色温计测定如OLYMPUSPM-CTR。
第二章进行显微摄影
一．显微摄影的基础知识
1．显微摄影装置的放大倍率
照片的放大倍率，决定于照相目镜的型号和显微摄影装置的投影长度。
如前所述，目前光学显微镜的光路系统是万能无限远光学校正系统，与以前的有限远光学校正系统有了很大的改进。
所以两种系统的照片放大倍率计算方法不同。
（1）有限远光学校正系统：
照片总放大倍率=物镜放大倍率X照相目镜放大倍率（没有中间附件时）或照片总放大倍率=物镜放大倍率X照相目镜放大倍率X中间附件系数（连接有中间附件时）。
（2）万能无限远光学校正系统：
照片总放大倍率=物镜放大倍率X照相目镜放大倍率（中间附件不影响放大倍率）。
（3）大版照相：
照片总放大倍率=物镜放大倍率X照相目镜放大倍率X3。
照片的总放大倍率是指底片上图象的放大倍率，而不是指底片冲洗到相纸后的放大倍率。
2．物镜与目镜的不同组合，得到的分辨率不同
即使照片的总放大倍率相同，它的分辨率是根据物镜、目镜的不同组合而不同的。
在显微摄影时应尽量使用低倍照相目镜与高倍物镜组合，这就样能改进底片平面象的分辨率。
3．标本画面的构图
显微摄影时，视场中的标本往往不适合摄影构图，克服这个问题的办法是转动照相机，以使标本成比例得适合构图的要求。
但这时要进行操作显微镜来适合摄影构图就更困难了。
一般人们乐用的方法是转动载物台，将标本调到画幅理想的构图中。
二．显微摄影技术
1．工作前的准备
（1）光路系统的清洁 显微摄影必须保证光路系统的清洁，任何光学部件有了污垢及灰尘，均会影响照片的质量。
物镜、目镜及聚光镜等部件，如污垢长期得不到清理，还会引起霉菌的生长，致使不能应用。
各部件在擦拭时，只能清理表面，而不应任意拆卸。
（2）光轴中心的调整 显微摄影时光轴中心的调整是绝对不可忽视的，否则拍出的图象，各部分的感光不匀。
关于调整的方法前已述及，这里不予重复。
（3）其它准备工作 检查镜体与照相系统的安装是否正确；
根据被检物体的情况选用何种感光片；
如为半自动和全自动照相系统，需调节好相应的按钮。
拍摄前需用观察目镜观察，先调好两眼的瞳距，使两个视场的象合而为一，再调节好两眼的屈光度以适应观察者的视力。
2．视场光阑与孔径光阑的应用
视场光阑的作用前已述及，在观察时根据物镜的倍率不同视场光阑开大或缩小而给予相应的光束面积，以达到镜检的优良效果。
在显微摄影时它起着增加和减弱影象反差的作用。
当视场光阑开大到一定程度时，照射到被摄物体上的光，即会产生反射与不规则的散射，造成影象反差的损失；
当视场光阑收缩到取景框边缘的外方时，图象的反差就得到改善；
视场光阑过度的收缩接近取景框，则图象的四角部分将被切去。
因此，在显微摄影时，视场光阑的应用是重要的一个因素，应开启到比取景框稍大的位置。
3．人眼屈光度的校正
镜检时，每人眼睛的屈光度不尽都一致，总是存在着一定的差别。
当甲看清视场中的图象后，乙来观察时就不一定清晰，这是由于两人眼睛的屈光度有所不同而造成的，这一差别很易解决，只要调节一下微调焦旋钮就很容易使图象清晰。
但是在显微摄影时，用这种方法是不能解决的，因为上述是通过改变工作距离的长短来补偿两人的屈光度；
而显微摄影则必须使物镜处于它本身的工作距离处，使成象清晰地落在感光片的平面处，才能使感光片得到清晰的图象。
往往有这样的经验，在视场中观察到的图象很满意，可拍摄出来的底片则模糊不清，就是这个原因。
显微摄影的调焦方法，必须利用取景侧目镜（聚焦望远镜）或取景目镜，首先进行屈光度的校正，即旋转取景侧目镜或取景目镜上的圆环，使取景框中的双十字线达到最清晰的程度，这时再进行调焦使图象清晰，便可进行曝光。
但应指出，应用同一只眼睛调节，不然两眼之间也会存在屈光度的差异。
在调节双十字线时，应尽快予以调整，否则长时间的调整，人眼将产生适应性，则不易调得准确，如遇此情况，可远眺前方稍待一段时间后再进行调节。
在使用4X以下物镜时，由于焦深较长，只用取景目镜还会发生调焦的误差，这时可利用“聚焦放大镜”来克服误差。
其方法是将聚焦放大镜放在取景侧目镜或取景目镜上，拧紧固定螺钉，再旋转该镜筒上的圆环，看清双十字线后物象是否同时清晰，如不清晰，再进行调节。
在使用10X和20X物镜时，当双十字线与图象同时清晰后，用眼环视一下，看双十字线与图象是否有移动现象，如果图象不移动，则说明焦点已对准；
如有移动，需用微调重新调节。
4．曝光的补偿
拍摄显微照片时，根据被摄物体组织结构所占帧幅面积的百分比需要调节曝光补偿。
在明场情况下，如果组织结构的各部分在帧幅内均匀分布，这样不论是平均测光还是点测光，都不需要曝光补偿；
若被摄物体所占的面积小或分散，则需要进行曝光补偿，加长一些曝光时间，否则被摄物体的曝光不够。
反之，在暗场情况下，物象是明亮的，在曝光的补偿上就需要减少一些曝光时间。
5．感光片倒易率失效的补偿
感光片感光乳剂的曝光，有着一定的规律—倒易律，即曝光是以投射到感光片表面上光的亮度而决定得。
根据这一规律，总曝光量为光的强度乘以时间的积。
在日常的照相中，如果光圈f/8时，则曝光时间为1/125s（秒）；
若将光圈缩小一档，即缩小为5/11，则曝光时间相应地增加一档，即为1/60s，这样两者的总曝光量是相同的，当显影后，底片上的密度也是相同的。
但当曝光时间超过一定范围后，则这一规律就不起作用，导致曝光不适和引起颜色还原的不良现象，这种现象称为“倒易律失效”（reciprocityfailure）。
在显微摄影中，不能通过聚光镜的孔径光阑的大小来补偿曝光时间，否则会影响物镜的成象质量，只有在倒易律的范围内适当延长或缩短曝光时间，才能获得适当曝光的底片及密度水平。
在全自动显微摄影装置的控制器上，装有倒易律失效旋钮，可根据不同感光片所指出的倒易律失效系数来设置，这样在曝光时，就能自动进行补偿，而获得合适的曝光效果，在彩色显微摄影中，对于这一规律的应用尤为重要。
三．彩色显微摄影
1.彩色感光片
目前市场有许多各种不同类型的彩色片，选择合适的型号才能获得理想的显微摄影效果。
（1）彩色感光片的分类
根据用途的不同，可分为彩色负片、彩色反转片与彩色正片。
彩色负片是经冲洗后，形成三原色的补色，经彩色相纸印放后，成为原色的图片；
彩色反转片经冲洗后，直接形成三原色，成为和物体颜色相同的透明正片；
彩色正片不能直接用于拍摄，只能供给彩色负片翻印成彩色透明正片。
根据拍照时所应用的光源不同，彩色负片与彩色反转片还分为日光型、灯光型以及混合型。
彩色正片只是灯光型。
日光型彩色片在拍照时，要求光源的色温在5500°
K左右；
灯光型则要求色温在3400°
至于混合型彩色片，对色温的要求约在4000°
K左右。
（2）选用彩色片的要求：
a）要求感光片有高解像力，因为显微照片需要显示标本的微细结构
b）要求对组织中的同一种颜色能显示标本颜色间深浅的微细差别
c）要求在背景不变的情况下，能真实地显示标本的原来颜色
鉴于以上要求，适合摄影用的彩色片必须具备下面条件：
a）微粒
b）颜色反差好
c）颜色还原好
由于大部分显微摄影是投射光的明场照明，因而选用感光度ISO/ASA50到100之间的彩色片，就能保证得到比较满意的质量。
当拍摄暗场（相衬、偏振光、荧光）时曝光时间要增加。
在多数情况下，选用高感光度ISO/ASA的感光片，因为需要感光度速度快。
虽然影象颗粒大一些，也不会有很大的影响。
2.滤色镜在彩色摄影中的应用
显微彩色摄影常用的滤色镜有以下几种
（1）色温转换滤色镜：
用于将显微镜照明光源的色温转换成底片所要求的标准。
根据底片的不同要选用相应的滤色镜。
（2）彩色补偿滤色镜（CC，ColorCompensation）：
当拍摄的彩色照片的背景不是白色而有颜色时，可参考下表选用补偿滤色镜
校正照片所偏的颜色需要加用的彩色补偿滤色镜
Red红青CCC
Green绿品红CCM
Blue蓝黄CCY
Cyan青红CCR
magenta品红绿CCG
Yellow黄蓝CCB
四．黑白显微摄影
1．黑白感光片
由于显微摄影所需要的拍摄条件与一般摄影不同，因而要根据摄影条件来选择感光片。
例如，生物学的标本需要反差强、颗粒细的感光片，以得到清晰度高的摄影效果，这类感光片在市场上是能买到的，如KodakPanatomicX、Agfapan25、IlfordPanF和FujiNeopanF。
黑白感光片的型号很多，要使拍摄出来的照片质量优良，必须选用合适的感光片。
下表供使用中参考。
标本组织的条件选用的感光片ISO/ASA备注。
普通病理学标本染色的部分，需要得到正常反差习惯，或者是高反差的效果KoadkPanatomic-XIlfordPanFAgfapan25FujiNeopanF32502532按标本的颜色选用不同反差效果的滤色镜。
病理学标本组织片染色的部分以及其它部分，需要得到低反差，要求标本外形的清晰度比其内部结构的层次更重要KodakTechicalPan2415Agfaortho25FujiMinicopyHR-11641002532这类感光片反差很高，而感光宽容度很窄。
除非事先试拍，找出最佳曝光时间以后，再将曝光调节钮放在±
1/3档上，这样才能得到既不曝光过度，也不曝光不足的正常底片。
暗背景的标本组织，需要长时间的曝光，才能得到正常底片的密度KodakTri-XPanAgfapan400IlfordHP5IlfordXP1FujiNeopan40040040040050-1600400用这一类感光片，曝光时间缩短，但底片影象的颗粒就变粗了。
2．滤色镜在黑白摄影中的应用
黑白感光片没有对色温的要求，一般不需要色温平衡滤色镜和补偿滤色镜。
应用最多的为反差滤色镜。
反差滤色镜用来控制黑白摄影的反差。
常用的是绿色滤色镜，但要得到最有效果的滤色镜，还要根据标本的特点来选择。
可增强标本颜色的滤色镜请参考下表：
标本的颜色 滤色镜的颜色
红色 / 黄色绿色
黄色 / 橙色蓝色
蓝色 / 橙色
如果要减弱标本的反差，请用与标本颜色相同的滤色镜。
例如，蓝色标本组织就用蓝色滤色镜，这可以使蓝色的标本组织反差降低。
其它色依此类推。
四．OLYMPUS显微镜光学系统简介
OLYMPUS显微镜光学系统的设计有三种光学系统。
1长筒光学系统（LB）：
OLYMPUSCH2、BH2显微镜是此种光路设计。
2万能无限远校正光学系统（UIS）：
应用在OLYMPUS最新型显微镜如BXIXCX等。
UIS是目前最先进的光路设计，它分体现了无限远校正方式的优越性。
光线通过物镜后成为平行光束通过镜筒，并在结象透镜处折射或完成无相差的中间象。
物镜与观察筒内结象透镜之间可添加光学附件，而不影响总放大倍数。
另外UIS光学系统不需要安装附加校正透镜，在一切OLYMPUSBX系统构成中都能得到最佳的显微图象。
第三章显微镜的重要光学技术参数
在镜检时，人们总是希望能清晰而明亮的理想图象，这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。
只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果。
显微镜的光学技术参数包括：
数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。
这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。
一．数值孔径
数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。
其数值的大小，分别标在物镜和聚光镜的外壳上。
数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（h）和孔径角（u）半数的正玄之乘积。
用公式表示如下：
NA=hsinu/2
孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。
孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。
显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率h值。
基于这一原理，就产生了水浸系物镜和油浸物镜，因介质的折射率h值大于一，NA值就能大于一。
数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。
目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。
这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。
数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。
它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。
二．分辨率
分辨率又称“鉴别率”，“解想力”。
是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。
显微镜的分辨率用公式表示为：
d=l/NA
式中d为最小分辨距离；
l为光线的波长；
NA为物镜的数值孔径。
可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。
NA值越大，照明光线波长越短，则d值越小，分辨率就越高。
要提高分辨率，即减小d值，可采取以下措施
1．降低波长l值，使用短波长光源。
2．曾大介质h值和提高NA值（NA=hsinu/2）。
3．增大孔径角。
4．增加明暗反差。
三．放大率
放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积。
放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好，在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。
四．焦深
焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。
焦深大,可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系：
1．焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。
2．焦深大，分辨率降低。
3．由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难。
在显微照相时将详细介绍。
五．视场直径（Fieldofview）
观察显微镜时，所看到的明亮的原形范围叫视场，它的大小，是由目镜里的视场光阑决定的。
视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。
视场直径愈大，愈便于观察。
F=FN/Mob
F:
视场直径，FN：
视场数，Mob:
物镜放大率。
视场数（FieldNumber,简写为FN），标刻在目镜的镜筒外侧。
由公式可看出：
1．视场直径与视场数成正比。
2．增大物
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