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２０１３

年第

８

期

总第

３８

卷

中国调味品

ＣＨＩＮＡ　ＣＯＮＤＩＭＥＮＴ　　

光合细菌是地球上最古老、最原始的细菌类群之

一，富含丰富的类胡萝卜素等光合色素。

类胡萝卜素

作为全球生态系统中一大类色素，是自然界中十分重

要的色素之一。

据估计，每年天然产生的类胡萝卜素

达

１

亿吨

［

２

］

。

类胡萝卜素是重要的营养素来源

３

它作为一种功能性色素，被用于食品

４

和化妆品添加

剂

５

的同时，也受到医学界的广泛瞩目。

自

１９５６

年英

国人

Ｈａｒｍａｍ

提出自由基学说

６

以后，抗氧化剂便成

为人们研究的热点。

类胡萝卜素在抗氧化介质模型中

的肿瘤防治机理显示出比酶更强的优势。

目前，光合

细菌

培养条件对类胡萝

卜素产量的影响研究多限于单因素和正交设计，此设

计实验次数多且不准确。

本文在单因素试验的基础

上，采用响应面法对光合细菌

Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ

ＲｕｂｒｕｍＳ１

产类胡萝卜素的培养条件进行了优化，以

期提高光合细菌类胡萝卜素的产量，为深入研究和规

模化生产类胡萝卜素提供依据。

１　

实验材料与仪器

１．１　

实验菌株

光合细菌

，日本关西

学院大学小山研提供。

１．２　

培养基

柠檬酸为

３．５２９１ｇ

，牛肉膏为

３．３１９０ｇ

ＭｇＳＯ

为

０．５０８３ｇ

ＦｅＳＯ

０．０１９４ｇ

ＫＨ

ＰＯ

０．５ｇ

和无菌水为

１Ｌ

１．３　

实验仪器

ＬＲＨ－３００－ＧＳ

型人工气候箱

广东省医疗器械

厂；

７２１

型紫外分光光度计

上海光谱仪器有限公司；

ＭＬＳ－３７５０

型高压自动灭菌锅

日本

ＳＡＮＹＯ

超净

工作台

苏净集团安泰公司；

Ｊ６－Ｍｉ

型大容量冷冻离

心机

　Ｂｅｃｋｍａｎ

厂家；

ＳＢＢ

型沸水浴槽

一科仪器

ＴＨＺ－８２

型恒温振荡器

江苏省金坛市医疗器械

ｐＨＳＴ－３Ｆ

型实验室

ｐＨ

计

上海雷磁；

电热恒温

干燥箱

上海实验仪器厂；

ＥＳＪ２００－４

型电子分析天平

沈阳龙腾电子有限公司。

２　

实验方法

２．１　

培养方法

按

１０％

接种量将种子液接种于新鲜的液体培养

基中，在培养温度为

２８℃

，光照强度为

４０００ｌｘ

和厌

氧条件下培养

天。

２．２　

菌体产量

在

Ｍａｒｉａ

等

７

的基础上加以改进。

菌液在

１００００ｒ

ｍｉｎ

条件下离心

２０ｍｉｎ

，弃去上清液，菌体用

蒸馏水洗涤

次后再次离心。

所得菌体在

６５℃

下烘

干至恒重。

２．３　

类胡萝卜素测定方法

在王岁楼

的基础上加以改进。

菌体中加入浓度

５ｍＬ

３Ｎ

的盐酸，

下振荡

１．５ｈ

后，沸水浴

４ｍｉｎ

，迅速冷却，离心（

）弃上清

液，沉淀用双蒸水洗涤

遍。

在所得菌体中加入

３ｍＬ

丙酮，

２８℃

水浴振荡浸提

３０ｍｉｎ

冷冻离

心

，取上清液。

适当稀释类胡萝卜素提取液，

于

４８０ｎｍ

处测定吸光值。

按以下公式计算类胡萝卜

素产量：

类胡萝卜素产量（

ｍｇ

＝ＡＤＶ

０．１６Ｖ

式中：

Ａ

处的吸光值；

Ｄ

为稀释倍数；

０．１６

为类胡萝卜素消光系数；

Ｖ

为加入的提取剂体

积；

为用于提取色素的发酵液体积。

２．４　

起始发酵培养条件的确定

２．４．１　

温度的确定

本实验将培养温度分别设定

１５

２０

２５

３０

３５

４０℃

，培养条件见

２．１

实验时设置

个平行，测定类

胡萝卜素的平均含量，以类胡萝卜素产量为指标来确

定最佳培养温度。

２．４．２　

光照强度

本实验将光照分别设定

１０００

２０００

３０００

４０００

５０００ｌｘ

个平行，测定

类胡萝卜素的平均含量，以类胡萝卜素产量为指标来

确定最佳培养温度。

２．４．３　

接种量的确定

培养条件见

，只改变接种量。

分别在培养基

中接入

５％

１５％

２０％

２５％

种子液，实验时设

置

个平行，测定类胡萝卜素的平均含量，以类胡萝卜

素产量为指标来确定菌种最佳接种量。

２．４．４　

中心组合优化培养基

采用响应面法在三因素三水平上对影响光合细菌

ＣＨＩＮＡ　ＣＯＮＤＩＭＥＮＴ

　　Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ＲｕｂｒｕｍＳ１

发酵的关键因子进行优

化，试验因子和水平见表

表

响应面分析因素与水平表

因素

水平

－１　０　１

培养温度（

Ｚ

）（

℃

２５　３０　３５

光照强度（

ｌｘ

２５００　３０００　３５００

接种量（

％

１０　１５　２０

３　

结果与讨论

３．１　

发酵培养条件的确定

３．１．１　

培养温度对类胡萝卜素产生的影响

培养温度是工业微生物发酵过程中最重要的培养

条件。

在光合细菌

发酵

过程中，温度是影响发酵很重要的因子。

不同培养温

度对光合细菌

生长效果

的影响，见图

图

由图

可知，当温度高于

１５℃

时，随着温度的提

高，类胡萝卜素产量在逐渐增加；

至

３０℃

时，类胡萝卜

素产量达到最高值；

但温度高于

３０℃

时，光合细菌

的类胡萝卜素产量开始

缓慢降低，确定最佳温度为

３．１．２　

光照对类胡萝卜素产生的影响

光合细菌在黑暗条件下，色素合成能力很微弱；

弱光下，则通过加大色素的合成以吸收较多的光能；

而

光照强度超过极限值后，色素的合成及光合成膜的形

成受到抑制，使色素分解，类胡萝卜素产量反而有所下

降。

因此，光合细菌

的类

胡萝卜素合成需要适当的光照强度。

光照强度对类胡

萝卜素的影响见图

光照强度对类胡萝卜素产生的影响

由图

可知，光合细菌在光照强度在

１０００～

３０００ｌｘ

范围内，其类胡萝卜素、菌体产量均随着光照

强度的增加而增加；

４０００～５０００ｌｘ

光照条件下，细胞

老化较快，易出现细胞碎片附壁现象。

因而，

是光合细菌

的适宜光照

强度。

３．１．３　

接种量对类胡萝卜素产生的影响

将光合细菌

接种液

体按

接种量接种于光合细

菌培养基中，置于

，光照强度

培养，定时

取样测定其生长情况。

接种量对类胡萝卜素的影响见

可知，随着接种量的增加，光合细菌的生长

速度相应地增加。

然而，当接种量大于

以后，增

加不明显，因此确定

是最佳的接种量。

３．２　

中心组合培养条件优化结果

在单因素结果的基础上，以

Ｘ

＝

－３０

）／

－３０００

５００

－１５

为自变量，以

类胡萝卜素产量

Ｙ

为响应值，进行三因素三水平的响

应面分析试验，实验结果见表

３６

ＣＨＩＮＡ　ＣＯＮＤＩＭＥＮＴ表

响应面分析方案及实验结果

试验号

１－１－１　０　１４．９２

２－１　１　０　１５．８４

３　１－１　０　１６．８１

４　１　１　０　１５．９８

５　０－１－１　１５．６９

６　０－１　１　１５．１６

７　０　１－１　１５．４９

８　０　１　１　１６．５０

９－１　０－１　１５．１１

１０　１　０－１　１５．７９

１１－１　０　１　１５．６７

１２　１　０　１　１６．３３

１３　０　０　０　１６．７３

１４　０　０　０　１６．８０

１５　０　０　０　１６．６９

中试验点

１～１２

为析因试验，

１３～１５

为中心

试验。

个试验点分为析因点和零点，其中析因点为

自变量取值在

所构成的三维顶点。

零点为

区域的中心点，零点试验重复

次，用以估计试验误

差。

对表

中数据进行分析，得到响应值对

个自变

量的多项二次回归方程为

Ｙ＝１６．７３９８３＋

０．４２０９３８Ｘ

＋０．１５２６２５Ｘ

＋０．１９７５６２Ｘ

－

０．４１６６０４Ｘ

－０．４３６５Ｘ

－０．００５８７５Ｘ

０．４３５４７９Ｘ

＋０．３８６５Ｘ

－０．５９５８５４Ｘ

为响应值类胡萝卜素产量，

和

分别为温度、光照强度和接种量的编码值。

模型的预

测值和真实值高度相关，相关系数为

Ｒ＝９５．６８％

这

表明了拟合的二次响应面方程很好地解释了中心组合

实验。

方程中的各个因子对响应值的影响关系可以通

过

ｔ－

检验进行研究。

回归模型的系数显著性检验的结果见表

模型系

数检验结果表明：

回归方程的一次项

对模型的影响非

常显著，

对模型影响较显著。

同时

项对模

型也有极高的显著性，这说明模型的响应值变化相对复

杂，不是简单的线性关系，曲面效应显著。

回归分析结果

方差来源

自由度

ＤＦ

平方和

ＳＳ

均方

ＭＳ

Ｆ

值

Ｐｒ＞Ｆ

１　１．４１７５　１．４１７５　２８．０５２６　０．００３２

１　０．１８６４　０．１８６４　３．６８８０　０．１１２９

１　０．３１２２　０．３１２２　６．１７９４　０．０５５４

１　０．６４０８　０．６４０８　１２．６８２１　０．０１６２

１　０．７６２１　０．７６２１　１５．０８２６　０．０１１６

１　０．０００１　０．０００１　０．００２７　０．９６０３

１　０．７００２　０．７００２　１３．８５７４　０．０１３７

续

１　０．５９７５　０．５９７５　１１．８２５２　０．０１８５

１　１．３１０９　１．３１０９　２５．９４３３　０．００３８

回归

９　５．５８９８　０．６２１１　１２．２９１４　０．００６５

线性

３　１．９１６１　０．６３８７　１２．６４００　０．００９０

平方

３　２．３１３９　０．７７１３　１５．２６４１　０．００６０

交互

３　１．３５９８　０．４５３３　８．９７０２　０．０１８７

通过多元回归方程所做的响应曲面图及其等高线

图见图

所拟合的响应曲面和等高线图能比较直观

地反应各因素和各因素间的交互作用。

４　

ａ

ｂ

ｃ

））响应面及等高线图

可知，

个响应曲面均为开口向下的凸形曲

面，同时等高线最小椭圆的中心在所选的

－１～１

范围

内，说明响应值（类胡萝卜素产量）在

个因子设计的范

围内存在最大值，说明这

个因子在此范围内的优化是

合理可行的。

）中的等高线为椭圆形状，同时低编

码值的

和高编码值的

时，响应值

随着

的变

化，变化趋势不同；

同时也表现在

变化时，

在高低

不同的取值时，

值的变化趋势也不同，说明

（温度）

（光照强度）的交互效应显著，这与方差分析的结

果相吻合。

）中表现了和图

）中同样的效应，

在低水平和高水平时，随着

的增大，

值表现出不同

的趋势，说明

（光照强度）和

（接种量）的交互效应

显著，这也与方差分析的结果相吻合。

利用

ＳＡＳ

工具箱对回归方程进行一阶求偏导，得到

响应值（

）处于最大值时的

的编码值分别为

＝０．５０８４

＝－０．００８３

＝０．１６０６

，即最佳提取工艺

条件：

培养温度为

３２℃

２９９５．８５　１ｘ

，接种量

１５．８％

，此时预测值为

１６．８６ｍｇ

３．３　

验证实验

为了检测模型和优化结果的准确性，配制分析得

到的最优条件进行发酵实验，

次平行验证的平均类

胡萝卜素产量为

１６．７２ｍｇ

，理论值为

与理论值相差

０．８３％

，在模型允许的误（下转第

４２

页）

３７

　　由表

可知，含防腐剂的对照蚝油样品防霉效果

最好，霉菌数在保存期内逐渐下降；

去除防腐剂后，其

防霉效果明显降低，

天就出现长霉，

天则进一步长

霉、变稀。

使用优化条件制备的蚝油，其抑菌能力明显

优于去除防腐剂的对照样品，霉菌数在保存期内没有

发生增加，产品感官上也没有出现长霉、变稀等霉变现

象，说明样品有较好的抑菌能力。

结果表明：

利用食

盐、

和乙醇的协同抑菌作用可明显提高蚝油的防

霉效果。

结论

通过分离纯化及返接验证试验，得到了引起蚝油

霉变的两株霉菌。

食盐和乙醇对两株霉菌的抑菌作用随着其含量的

增加而增强，降低

对霉菌也有一定的抑制效果，但

单一因素的抑菌效果均不理想。

１３％

的盐含量只能在

一定程度上抑制霉菌的生长速度，并不能完全抑制或

杀死微生物；

单独依靠调节

在蚝油中发挥的抑菌

作用很弱；

的乙醇对抑制霉菌的生长速度有一定的

效果，

１％

的乙醇几乎没有抑菌作用。

三种因素综合对目标菌有较好的抑制作用，正交

试验结果表明三种因素的抑菌强弱顺序为食盐

＞

乙醇

＞ｐＨ

最优组合为食盐含量

ｐＨ　４．５

，乙醇含量

３％

，此条件下蚝油有较好的防霉效果。

参考文献：

］吴健勋，黄建蓉

．

食品防腐剂对菌落总数检测影响的研

究［

Ｊ

食品科技，

２０１０

）：

２９７－２９９．

］丁培峰

纳他霉素和茶多酚在酱油中的应用研究［

中国

调味品，

２０１１

２１－２４．

］张日生，晏会英

霉克在调味品———蚝油中的防腐应用［

食品工业科技，

２１

６６．

］任艳艳，张水华，李沛，等

酵母味素在蚝油生产中的应

用［

中国调味品，

２００３

１２

１３－１６．

］王向阳，姜丽佳

真空包装腌萝卜干中腐败微生物的抑制研

２００９

６９－７２．

］李德新，郭凤根，王仕玉，等

．３

种抑菌剂对蛇足石杉内生真

菌黑曲霉的抑制效果研究［

安徽农业科学，

３９

１２１０６－１２１０７

１２１１０．

］熊家娟

药品中防腐剂的抗菌效力测定与评价［

中国药

事，

２００５

１９

１０

５９２－５９４．

］李凤琴，李玉伟，王晔茹，等

食品用防腐剂防腐效果的测定

和评价程序研究［

卫生研究，

２８

６５７－６６１．

９

ＧＢ

Ｔ　２１９９９－２００８

，蚝油［

Ｓ

（上接第

页）差范围之内。

说明模型能较好地预测实

际发酵情况，得到的结果可以在实践中应用。

本文