12基因工程的一般过程与技术 学案苏教版选修3.docx
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12基因工程的一般过程与技术学案苏教版选修3
第2课时 基因工程的一般过程与技术
目标导航
1.简述基因工程的一般过程。
2.理解基因工程每个步骤的原理、方法和过程。
3.了解以原核细胞、植物细胞和动物细胞为表达体的基因工程的一般过程。
一、基因工程
1．以原核细胞为表达体的基因工程
（1）过程：
以原核生物细胞（如大肠杆菌）为重组DNA表达体的基因工程的“施工”过程主要包括________________、________________、________________、筛选获得目的基因的受体细胞、________________并实现目的基因____________等五大步骤。
（2）图示：
2．以植物细胞为表达体的基因工程——抗软化番茄的培育过程
二、转基因动物生产方法
最常用的方法主要有两种，即________________的方法和____________________法。
三、转基因技术
1．常用的动物转基因技术有______________________和________________。
2．常用的植物转基因技术：
____________________技术、基因枪介导转化技术、____________技术。
知识点一 目的基因获取的方法
1．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（ ）
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因
A．①②③④B．①②③
C．②③④D．②③
2．下列有关PCR技术的说法不正确的是（ ）
A．PCR技术是在细胞内完成的
B．PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
C．PCR技术的原理与DNA复制的原理相同
D．PCR技术的前提是有一段已知的目的基因的核苷酸序列
知识点二 制备重组DNA分子和转化受体细胞
3．在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是（ ）
A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸
B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体
C．将重组DNA分子导入烟草原生质体
D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
4．下图为某种重组质粒简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。
已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。
据图回答：
（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有______________________、______________________、________________________三种。
若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行____________________________。
（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。
之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是______________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________________。
（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是________，其合成的产物是________________。
（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是________________________。
知识点三 筛选重组细胞和实现功能表达
5．下图为用于基因工程的一个质粒示意图。
用EcoRⅠ限制酶切割目的基因和该质粒，再用DNA连接酶连接形成重组质粒，然后导入大肠杆菌，最后将大肠杆菌放在四种培养基中培养：
a—无抗生素的培养基，b—含四环素的培养基，c—含氨苄青霉素的培养基，d—含四环素和氨苄青霉素的培养基。
含重组质粒的大肠杆菌能生长的是（ ）
A．aB．a和c
C．a和bD．b和c
6．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。
下列属于目的基因功能表达检测和鉴定的是（ ）
①检测受体细胞是否有目的基因 ②检测受体细胞是否有致病基因 ③检测目的基因是否转录mRNA④检测目的基因是否翻译蛋白质
A．①②③B．②③④
C．①③④D．①②④
知识点四 基因工程的全过程
7．回答有关基因工程的问题：
（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生______末端。
若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生________（相同、不同）黏性末端的限制酶。
（2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_________________________________________________________
________________________________________________________________________。
在用表达载体转化大肠杆菌时，常用________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为____________。
为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成____________，常用抗原—抗体杂交技术。
（3）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的______________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的________上。
8．回答下列有关基因工程的问题：
（1）基因工程中使用的限制酶，其特点是__________________________________。
下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。
（2）将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X－1混合连接，连接后获得的质粒类型有________________。
（可多选）
A．X－1B．X－2C．X－3D．X－4
（3）若将上图所示X－1、X－2、X－3、X－4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。
在这两种培养基上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有________________、________________。
（4）如果X－1用E1酶切，产生850对碱基和3550对碱基两种片段；那么质粒X－2（Tcr基因的长度为1200对碱基）用E2酶切后的片段长度为__________对碱基。
（5）若将外源的Tcr基因两端用E2切开，再与用E2切开的X－1混合链接，并导入大肠杆菌细胞，结果显示，含X－4的细胞数与含X－1的细胞数之比为1∶3，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？
________。
原因是_______________________________________
________________________________________________________________________。
基础落实
1．采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（ ）
①将毒素蛋白注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 ④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵
A．①②B．③④C．②③D．①④
2．基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是（ ）
A．人工合成目的基因B．目的基因与载体结合
C．转化受体细胞D．实现功能表达
3．下列有关基因工程技术的正确叙述是（ ）
A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、载体
B．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞
C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快
D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功表达
4．研究人员想将生长激素基因通过质粒导入大肠杆菌细胞内，以表达产生生长激素。
已知质粒中存在两个抗性基因：
A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因不插入基因A、B中，而大肠杆菌不带任何抗性基因，则筛选获得“工程菌”的培养基中的抗生素首先应该（ ）
A．仅有链霉素
B．仅有氨苄青霉素
C．同时有链霉素和氨苄青霉素
D．无链霉素和氨苄青霉素
5．如图为重组质粒的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是（ ）
A．氨苄青霉素抗性基因B．启动子
C．限制酶D．DNA连接酶
6．用某人的胰岛素基因制成的DNA探针，能与之形成杂交分子的是（ ）
①该人胰岛A细胞中的DNA ②该人胰岛B细胞中的mRNA ③该人胰岛A细胞中的mRNA ④该人肝细胞中的DNA
A．①③④B．①②③C．①②④D．②
能力提升
7．质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内，某细菌质粒上的标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。
外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示外源基因在质粒中可插入的位置有a、b、c点。
某同学根据实验现象对其插入的位点进行分析，其中分析正确的是（ ）
实验现象
实验推论
在含青霉素培养
基上的生长情况
在含四环素培养
基上的生长情况
目的基因
插入的位置
A
能生长
能生长
a
B
不能生长
能生长
b
C
能生长
不能生长
c
D
不能生长
不能生长
c
8.如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。
相关叙述中正确的是（ ）
A．这三种方法都用到酶，都是在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．①②③片段均不含内含子，但含非编码区
D．方法a不遵循中心法则
9．人们试图利用基因工程的方法，用乙种生物生产甲种生物的一种蛋白质。
生产流程是：
甲生物的蛋白质→mRNA
目的基因
与质粒DNA重组
导入乙细胞
获得甲生物的蛋白质，下列说法正确的是（ ）
A．①过程需要的酶是反转录酶，原料是A、U、G、C
B．②要用限制酶切断质粒DNA，再用DNA连接酶将目的基因与质粒连接在一起
C．如果受体细胞是细菌，可以选用枯草杆菌、炭疽杆菌等
D．④过程中用的原料不含有A、U、G、C
10.通过基因工程的方法，科学家采用花粉管通道法将毒蛋白基因转入棉花植株并获得成功表达。
棉铃虫吃了这种转基因棉花的植株后就会死亡。
花粉管通道法是指：
利用植物花粉萌发时形成的花粉管通道将毒蛋白基因送入胚囊，进而导入尚不具备细胞壁的合子或早期胚体细胞中，借助天然的种胚系统，形成含有目的基因的种胚。
请回答下列问题：
（1）下列所示的黏性末端是由________种限制性核酸内切酶作用产生的。
（2）利用花粉管通道法将毒蛋白基因导入棉花细胞，此过程是基因工程操作步骤中的第三步，即__________________。
获取目的基因时，如果基因比较小，核苷酸序列又已知，则可以通过DNA合成仪用化学方法直接______________。
（3）该目的基因在导入受体细胞前需要与载体结合，目前经常使用的载体是________________。
11．请回答基因工程方面的有关问题：
（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。
图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。
②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。
某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。
①第1组：
_________________________________________________________________；
②第2组：
_______________________________________________________________。
（3）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（4）用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图（1kb即1000个碱基对），请画出质粒上EcoRⅤ、MboⅠ的切割位点。
综合拓展
12．分析有关基因表达的资料，回答问题：
取同种生物的不同类型细胞，检测其基因表达，结果如下图。
（1）基因1～8中有一个是控制核糖体蛋白质合成的基因，则该基因最有可能是基因____________。
（2）如图所示细胞中功能最为近似的是细胞____________________________。
A．1与6B．2与5
C．2与3D．4与5
（3）判断图中细胞功能近似程度的依据是________________________________________
________________________________________________________________________。
（4）现欲研究基因1和基因7连接后形成的新基因的功能，导入质粒前，用限制酶切割的正确位置是____________________________________________________________。
（5）下图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将新基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的限制酶是____________。
A．HindⅢB．EcoRⅠ
C．EcoBD．PstⅠ
（6）新基因与质粒重组后的DNA分子导入受体细胞的概率很小，因此需进行__________，才能确定受体细胞已含有目的基因。
（7）在已确定有目的基因的受体细胞中，若质粒的抗青霉素基因缺失了两个碱基，将这样的受体细胞接种到含有青霉素的培养基中，该细胞中可能出现的结果是__________（多选）。
A．抗青霉素基因不能转录
B．基因1和7没有表达
C．基因1和7不能连接
D．质粒上的酶切位置发生改变
第2课时 基因工程的一般过程与技术
知识清单
一、1.
（1）获取目的基因 制备重组DNA分子 转化受体细胞 培养受体细胞 功能表达
（2）同一种限制性核酸内切酶 DNA连接酶 筛选 转化 2.重组DNA 农杆菌 不能合成多聚半乳糖醛酸酶 抗多聚半乳糖醛酸酶
二、显微注射DNA 精子介导的基因转移
三、1.显微注射技术 体细胞核移植技术
2．农杆菌介导转化 花粉管通道
对点训练
1．D [PCR利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板链。
反转录法则是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在反转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。
①④则不需要模板。
]
思路导引 熟悉获取目的基因的方法是准确解答本题的关键。
知识链接 目的基因获取的几种方法
（1）直接分离：
从自然界中已有的物种中分离，如从基因文库中获取。
（2）人工合成目的基因
已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪，用化学方法合成，不需要模板。
（3）利用PCR技术扩增目的基因
利用DNA双链复制的原理，在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量成指数方式增加。
2．A [PCR技术的场所为细胞外，A错误，B正确；PCR技术的原理与DNA复制相同，C正确；PCR技术需要一小段已知序列的核酸作为引物，D正确。
]
思路导引 PCR技术是根据DNA复制的原理，在体外快速大量复制DNA的技术。
归纳提升 PCR技术扩增目的基因与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相
同
点
原理
碱基互补配对
原料
四种脱氧核苷酸
条件
模板、ATP、酶
不
同
点
解旋方式
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
场所
体外复制
主要在细胞核内
酶
热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）
细胞内含有的DNA聚合酶
结果
在短时间内形成大量的DNA片段
形成整个DNA分子
3.A [限制性核酸内切酶用于提取目的基因和切割载体，烟草花叶病毒的遗传物质是RNA，不能用限制性核酸内切酶切割，A项错误；DNA连接酶可以连接具有相同黏性末端的目的基因和载体，B项正确；受体细胞可以是受精卵和体细胞，也可以是去除细胞壁的原生质体，C项正确；目的基因为抗除草剂基因，所以未成功导入目的基因的细胞不具有抗除草剂的能力，筛选时应该用含除草剂的培养基筛选转基因细胞，D项正确。
]
思路导引 限制酶切割的为DNA分子；烟草花叶病毒的核酸为RNA。
知识链接
（1）重组DNA分子的制备
①目的基因是指编码蛋白质的结构基因，没有启动子，若只将目的基因导入受体细胞中无法转录。
②目的基因的表达需要调控序列，因而用做载体的质粒插入目的基因时须有启动子，插入后须有终止子。
③目的基因是否导入受体细胞中需要有筛选标记——标记基因。
因此，一个重组DNA分子的组成至少应该包括：
启动子、终止子、目的基因、标记基因。
（2）受体细胞不同转化的方法不同
①转入动物细胞的方法
②转入植物细胞的方法
（3）目的基因导入受体细胞的结果
上图中发生②与发生①相比，②会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是在进行细胞分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，而①细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。
4．
（1）目的基因—载体连接物 载体—载体连接物 目的基因—目的基因连接物 分离纯化
（2）载体—载体连接物 目的基因—载体连接物、载体—载体连接物 （3）启动子 mRNA （4）EcoRⅠ和BamHⅠ
解析
（1）在基因表达载体的构建过程中用同种限制酶来切割目的基因和质粒，使之产生相同的黏性末端，以利于DNA片段的连接。
将切割后的目的基因和质粒，用DNA连接酶进行连接，它们之间随机连接，可有三种产物：
目的基因—载体连接物、载体—载体连接物和目的基因—目的基因连接物。
获得DNA连接产物以后，必须通过筛选才能获得所需的基因表达载体，导入宿主细胞后才能表达获得基因产物。
（2）从图中可以看出，目的基因的插入位点在抗四环素基因上，可推知：
目的基因—载体连接物的抗四环素基因被破坏，丧失了抗四环素的能力，但保留了抗青霉素的能力；载体—载体连接物既保留了抗四环素的能力也保留了抗青霉素的能力；目的基因—目的基因连接物既无抗青霉素基因也无抗四环素基因，不具备抗性。
（3）目的基因表达过程中，RNA聚合酶首先与启动子结合，指导目的基因转录产生mRNA，mRNA再指导蛋白质的合成。
（4）从图中可看出抗四环素基因上有两个不同的切割位点，所以在实际操作过程中，为避免切割后的末端任意连接，可用EcoRⅠ和BamHⅠ同时对目的基因和质粒进行切割，使同一切割产物的黏性末端不同。
思路导引 发散思维：
将同一种限制酶切割后的目的基因与质粒混合后，DNA片段间的连接方式？
注意图示观察：
酶切后，哪种抗性基因失活？
回忆基因表达的相关知识。
归纳提升 将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有：
（1）自连
（2）片段间的连接
其中片段间的连接又有两个片段间、三个片段间、多个片段间等。
5．B [如图，在EcoRⅠ限制酶的作用下，四环素抗性基因失活，所以导入大肠杆菌后，应使大肠杆菌具有抗氨苄青霉素的能力，而无抗四环素的能力。
]
思路导引 质粒上有两个抗性标记基因；由于目的基因的插入导致一个抗性基因失效。
知识链接 重组细胞筛选的方法
（1）插入灭活筛选法：
ampr氨苄青霉素抗性基因
tetr四环素抗性基因
tets失活的四环素抗性基因
析图：
①质粒中ampr和tetr完好；②tetr内部插入外源基因，使该基因失活，变为tets；③将转化的受体细胞涂布在含氨苄青霉素的培养基中培养，获得菌落，这些菌落的大肠杆菌均导入了质粒；④原位影印菌落在四环素的培养基中；⑤对比分析：
凡是在氨苄青霉素培养基中能生长而且在四环素培养基中不能生长的菌落，就是带重组质粒的菌落。
（2）核酸筛选法——核酸杂交法。
（3）蛋白质筛选法——抗原—抗体杂交法。
6．C [目的基因的检测包括：
检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针，使DNA探针与基因组DNA杂交；检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是用基因探针与mRNA杂交；最后检测目的基因是否翻译了蛋白质，方法是进行抗原—抗体杂交。
]
思路导引 本题为知识拓展考查的内容，先阅读下列知识拓展，再独立完成相关选项的判断思考。
知识拓展 目的基因功能表达的检测与鉴定
目的基因导入受体细胞是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知识，这是检查基因工程是否成功的一步。
类型
步骤
检测内容
方法
结果
分子
检测
第一步
目的基因是否进入受体细胞
DNA分子杂交（DNA和DNA之间）
是否显示出杂交带
第二步
目的基因是否转录出信使RNA
分子杂交技术（DNA和RNA之间）
是否显示出杂交带
第三步
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交方法
是否显示出杂交带
个体水平检测
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等
7.
（1）平口 相同
（2）RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质 Ca2＋ DNA分子杂交技术 人胰岛素 （3）T DNA 染色体的DNA
解析
（1）限制酶能识别特定的DNA序列，并在特定位点上切割DNA，形成黏性末端或平口末端；要使目的基因和质粒直接进行连接，应使用同一种限制酶进行切割，使二者产生相同的黏性末端。
（2）启动子为DNA序列，其具有RNA聚合酶结合位点，能启动转录，合成RNA；将基因表达载体导入大肠杆菌时，常用Ca2＋处理；检测目的基因时，常用分子杂交技术检测目的基因或相应的mRNA，或采用抗原—抗体杂交技术鉴定相应的蛋白质。
（3）用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞时，首先将目的基因导入农杆菌Ti质粒的T DNA中，再利用农杆菌侵染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的染色体的DNA上。
知识链接 基因工程的图解
（1）抗虫棉的培育过程
（2）利用基因工程技术生产凝乳
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