生物选修一52多聚酶链式反应扩增DNA片段学案人教版.docx

生物选修一52多聚酶链式反应扩增DNA片段学案人教版.docx

《生物选修一52多聚酶链式反应扩增DNA片段学案人教版.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物选修一52多聚酶链式反应扩增DNA片段学案人教版.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

生物选修一52多聚酶链式反应扩增DNA片段学案人教版

生物选修一5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段学案（人教版）

本资料为woRD文档，请点击下载地址下载全文下载地址www.5y

　　课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段

　　问题导学

　　一、PcR的原理

　　活动与探究1

　　．细胞内DNA复制需要的基本条件有哪些？

该条件在DNA复制中起何作用？

　　2．什么是引物？

它有什么特点？

用于PcR的引物一般长度是多少？

　　3．讨论：

DNA合成的方向有什么特点？

两条子链的合成起始于DNA的同一端吗？

　　4．PcR技术中，高温能使DNA双链解旋，但也会导致DNA聚合酶失活，如何解决？

　　迁移与应用1

　　PcR过程中起催化作用的酶是（　　）。

　　A．解旋酶　　　B．RNA聚合酶

　　c．TaqDNA聚合酶

　　D．DNA连接酶

　　细胞内DNA复制与PcR技术的比较

　　细胞内DNA复制

　　PcR

　　不

　　同

　　点

　　解旋

　　解旋酶催化，部分解旋解链

　　95℃高温解旋解链，双链完全分开

　　酶

　　解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶

　　TaqDNA聚合酶

　　能量

　　ATP

　　不加

　　温度

　　体内温和条件

　　95℃→55℃→72℃

　　特点

　　整个DNA复制，只在分裂间期复制一次

　　目的基因片段，按需要无限扩增

　　相同点

　　①需DNA模板；②需脱氧核苷酸作原料；③子链延伸方向都是从5′端到3′端；④都遵循碱基互补配对原则，半保留复制

　　注：

解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯键的。

　　二、PcR的反应过程

　　活动与探究2

　　．PcR一般要经历30多次循环，每次循环可以分为哪几步？

　　2．PcR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是什么？

　　3．PcR循环过程中，变性温度设置94℃，时间设置30s的原因是什么？

　　4．PcR缓冲液相当于细胞内的什么成分？

　　5．当PcR反应体系的温度由变性后缓慢冷却到50℃左右时，引物与模板可结合，而解开的两个DNA模板链能够重新结合吗？

为什么？

　　6．PcR过程中的DNA聚合酶能对最初的DNA模板进行完整的复制吗？

为什么？

　　7．决定PcR反应特异性的原因有哪些？

　　迁移与应用2

　　利用PcR技术扩增某DNA片段得到下图所示产物，则该产物至少经过几次循环才能产生？

（　　）

　　A．1次

　　B．2次

　　c．3次

　　D．4次

　　．PcR反应过程图解

（1）变性：

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：

（2）复性：

系统温度下降至55℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：

　　（3）延伸：

当系统温度上升至72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、G、c）在DNA聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：

　　2．PcR过程的温度条件和时间控制

　　变性

　　复性

　　延伸

　　预变性

　　94℃，5min

　　—

　　—

　　30次

　　94℃，30s

　　55℃，30s

　　72℃，1min

　　最后一次

　　94℃，1min

　　55℃，30s

　　72℃，1min

　　三、PcR实验操作和结果分析评价

　　活动与探究3

　　．讨论PcR实验过程中有哪些注意事项。

　　2．如何判断DNA扩增成功？

　　迁移与应用3

　　PcR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是（　　）。

　　A．反复洗涤　　

　　B．用酒精擦洗

　　c．高压灭菌

　　D．在－20℃下储存

　　．PcR体外扩增DNA片段的实验流程

　　准备　按照PcR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上

　　移液　用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分

　　混合　盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁

　　离心　将微量离心管放在离心机上，离心约10s。

目的是使反应液集中在离心管底部

　　反应　将离心管放入PcR仪中，设置程序进行反应：

变性―→复性―→延伸

　　2．实验中DNA含量的测定

　　DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。

可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：

（1）稀释：

2μLPcR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释

（2）对照调零：

以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零

　　（3）测定：

取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值

　　（4）计算：

DNA含量（μg/mL）＝50×（260nm的读数）×稀释倍数

　　3．几种PcR方法

　　有反转录PcR、扩增未知序列的PcR、致突变PcR、定量PcR、免疫PcR等方法，PcR还可与其他方法联合使用，有很多新的联合法。

（1）反转录PcR

　　反转录PcR就是把RNA提取后反转录成互补DNA，并以此互补DNA链为模板进行的PcR反应。

通常用于检测某种RNA是否被表达，或者比较其相对表达水平。

（2）实时荧光定量PcR

　　所谓的实时荧光定量PcR就是通过对PcR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。

在实时荧光定量PcR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PcR的进行，PcR产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

　　（3）免疫PcR

　　免疫PcR是利用抗原抗体反应的特异性和PcR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。

　　答案：

　　课前•预习导学

　　【预习导引】

　　一、1．体外　DNA　DNA拷贝

　　2．解旋　DNA母链　脱氧核苷酸　DNA聚合

　　预习交流1：

提示：

DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。

因此，DNA复制需要引物，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

　　3．80～100℃　双螺旋　双链　变性　降低　双链

　　4．缓冲　DNA　两条模板链　引物　脱氧核苷酸　TaqDNA聚合　温度

　　二、1．变性　90℃　解旋　95

　　2．复性　50℃　两种　碱基互补配对　55

　　3．延伸　72℃　TaqDNA聚合酶

　　预习交流2：

（1）提示：

DNA分子首先在解旋酶的作用下解旋，然后以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下合成与母链碱基互补的一段子链，随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也不断延伸，同时，每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。

（2）提示：

PcR在高温条件下（90～100℃）解旋，而细胞内的DNA在解旋酶的作用下解旋。

　　三、1．温度　3　恒温水浴锅

　　2．塑料管　0.5mL

　　3．微量移液器

　　四、1．外源DNA　高压灭菌

　　2．分装成小份　－20℃

　　3．枪头　更换

　　预习交流3：

提示：

是用塑料加工制作的。

　　课堂•合作探究

　　【问题导学】

　　活动与探究1：

　　．提示：

细胞内DNA复制需要的基本条件和作用分别是：

（1）解旋酶：

打开DNA双链。

（2）DNA母链：

提供DNA复制的模板。

（3）4种脱氧核苷酸：

合成子链的原料。

（4）DNA聚合酶：

催化合成DNA子链。

（5）引物：

使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。

　　2．提示：

引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。

用于PcR的引物长度通常为20～30个核苷酸。

　　3．提示：

（1）DNA的羟基末端称为3′端，磷酸基团的末端称为5′端，且DNA的一条链为3′→5′，另一条互补链为5′→3′，即DNA的两条链是反向的。

（2）DNA合成的方向总是从子链的5′端向3′端延伸（即沿母链的3′→5′），所以两条子链的合成分别起始于DNA的两端。

　　4．提示：

寻找和使用耐高温的DNA聚合酶。

　　迁移与应用1：

c　解析：

PcR技术解旋过程是利用了95℃高温使DNA变性解旋；RNA聚合酶是转录过程所需的酶；DNA连接酶是基因工程和DNA体内复制所需的酶；PcR技术延伸中所用的酶是TaqDNA聚合酶。

　　活动与探究2：

　　．提示：

每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。

　　2．提示：

预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。

　　3．提示：

变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增，变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。

　　4．提示：

由于缓冲液为DNA的复制提供场所，相当于细胞内DNA复制的场所，所以缓冲液相当于核基质。

　　5．提示：

不能。

（1）模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合。

（2）引物和模板之间的碰撞机会远远高于两个DNA模板链之间的碰撞机会。

（3）加入的引物的量较大，而模板数量少。

　　6．提示：

不能。

第一次循环时，只能从引用结合的部位开始。

由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，由引物Ⅱ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅰ结合，进行DNA的延伸之后，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。

　　7．提示：

（1）待扩增DNA片段的特异性。

（2）引物与模板特异性地结合。

（3）碱基互补配对原则。

（4）耐高温的TaqDNA聚合酶的催化作用具有专一性。

　　迁移与应用2：

B　解析：

PcR技术中，第一次循环产生两个DNA分子，每个DNA分子只有一条链具有引物。

第二次循环产生四个DNA分子，其中两个DNA分子只有一条链具有引物，另两个DNA分子两条链都具有引物。

　　活动与探究3：

　　．提示：

（1）避免外源DNA污染：

所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压灭菌。

（2）缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

　　（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

　　（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

　　2．提示：

（1）教材中的方法，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。

（2）电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

　　迁移与应用3：

c　解析：

为了避免外源DNA等因素的污染，PcR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

PcR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃下储存。

使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

　　当堂检测

　　．下列有关PcR的描述，不正确的是（　　）。

　　A．是一种酶促反应

　　B．引物决定扩增的特异性

　　c．扩增的对象是氨基酸序列

　　D．扩增的对象是DNA序列

　　答案：

c　解析：

PcR是特异扩增两个引物间的脱氧核苷酸序列，而不是氨基酸序列。

　　2．引物长度通常为20～30个核苷酸的一段（　　）。

　　A．DNA

　　B．RNA

　　c．DNA或RNA

　　D．双链DNA

　　答案：

c　解析：

DNA复制过程均需要引物的参与，引物是一小段RNA或DNA。

　　3．PcR利用了DNA的什么原理，来控制DNA的解聚与结合？

（　　）

　　A．特异性

　　B．稳定性

　　c．热变性

　　D．多样性

　　答案：

c　解析：

PcR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。

　　4．PcR过程中的复性是指（　　）。

　　A．在90℃以上时，两条DNA单链通过碱基互补配对形成DNA双螺旋

　　B．在50℃左右，两条DNA单链通过碱基互补配对形成DNA双螺旋

　　c．在90℃以上时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

　　D．在50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

　　答案：

D　解析：

PcR过程中的复性发生在50℃左右的低温条件下，指引物与单链DNA的结合，不是两条单链DNA的结合。

　　5．标准的PcR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是（　　）。

　　A．94℃、55℃、72℃

　　B．72℃、50℃、94℃

　　c．50℃、94℃、72℃

　　D．80℃、50℃、72℃

　　答案：

A　解析：

当温度上升到90℃以上时，作为模板的双链DNA解旋成为单链DNA，称之为变性；当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性；当温度回升到72℃左右时（TaqDNA聚合酶的最适反应温度），在单链上4种脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则连接在引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链，称为延伸。

　　用流程图表示PcR的操作步骤。

www.5y