疟原虫检验技术.ppt

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疟原虫检验技术疟原虫检验技术-血片制作、染色及疟原虫形态鉴别血片制作、染色及疟原虫形态鉴别黔东南州疾控中心黔东南州疾控中心检验科检验科潘雪雪寄生人体的四种疟原虫寄生人体的四种疟原虫间日疟原虫间日疟原虫P.vivaxP.vivax，P.vP.v恶性疟原虫恶性疟原虫PPFalciparum,P.fFalciparum,P.f三日疟原虫三日疟原虫PPMalariae,P.mMalariae,P.m卵形疟原虫卵形疟原虫PPOvale,P.oOvale,P.o我我国国主主要要是是间间日日疟疟原原虫虫和和恶恶性性疟疟原原虫虫；另另二二种少见，近年偶见国外输入病例。

种少见，近年偶见国外输入病例。

其它疟原虫诺氏疟原虫诺氏疟原虫（Plasmodiumnowlesi）内容提纲内容提纲血片制作与染色血片制作与染色疟原虫计数疟原虫计数疟原虫的基本形态特征疟原虫的基本形态特征血片制作血片制作第一步：

第一步：

载玻片的清洗载玻片的清洗用用加加有有洗洗洁洁精精或或洗洗衣衣粉粉的的热热水水洗洗涤涤，清清水水冲洗后凉干，浸于冲洗后凉干，浸于95%95%的乙醇中的乙醇中11小时以上小时以上用绸布擦干置干燥环境中保存。

用绸布擦干置干燥环境中保存。

第二步：

患都信息的核实采集血样涂片时，首先要核对患者的姓名和年龄并在玻片的右侧编号第三步：

采集血样第三步：

采集血样采血部位：

采血部位：

耳垂耳垂或无名指，或无名指，取血方法：

取血方法：

通常在耳垂取血，通常在耳垂取血，先用先用75%75%酒精棉球消毒取血部位，酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。

然后用右手不宜过深或过浅。

然后用右手中指轻轻挤压出血。

厚血膜血中指轻轻挤压出血。

厚血膜血量约一粒米大小量约一粒米大小,薄血膜血量为薄血膜血量为厚血膜的一半或厚血膜的一半或1/31/3。

厚血膜厚血膜用推片的一角，从取用推片的一角，从取血部位刮取约血部位刮取约44微升血量微升血量（相当于火柴头大小），（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向触，再由里向外一个方向旋转，转旋转，转2424圈，涂成直圈，涂成直径径0.810.81厘米大小圆形厚厘米大小圆形厚血膜血膜薄血膜薄血膜再取一小滴血再取一小滴血.将血置将血置于第一张玻片离厚血膜适于第一张玻片离厚血膜适当远的地方当远的地方.将将推片的边推片的边缘紧贴载玻片，轻轻上下缘紧贴载玻片，轻轻上下移动，使血液沿边缘散开，移动，使血液沿边缘散开，然后匀速地向前推进，形然后匀速地向前推进，形成薄而平铺的薄血膜成薄而平铺的薄血膜第四步：

血片制作第四步：

血片制作厚血膜薄血膜制片过程图示标签标准的疟疾厚薄血膜片标准的疟疾厚薄血膜片标签厚血膜血量不宜过多或过少薄血膜平整,无皱折和空泡.显微镜下红细胞单层排列血片的制作血片制作影响因素血片制作影响因素载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀分布不重叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜末端呈舌状；分布不重叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜末端呈舌状；厚血膜厚度以一个油镜视野内可见厚血膜厚度以一个油镜视野内可见5-105-10个白细胞为宜；个白细胞为宜；血片制作场所要保持清洁，以免尘埃沾污血膜，防止苍蝇血片制作场所要保持清洁，以免尘埃沾污血膜，防止苍蝇等舔食血膜；等舔食血膜；制成的血片在未干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要制成的血片在未干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果血片染色血片染色两种染色方法:

吉氏染色法1.染色原液配制2.门诊快染、慢染3.成批染色和溶血染色瑞氏染色法WHO推荐使用吉氏染色法吉氏染液吉氏染液（原液原液）的配置的配置吉氏染粉吉氏染粉（AzureBtype）5g甘油甘油（纯纯）250ml甲醇甲醇（纯纯）250ml吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨,然后边加边磨，然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在研钵中加入研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。

盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置反复数次，直至甲醇用完。

盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤经过滤即可使用。

保即可使用。

保存时间越长染色效果越好。

存时间越长染色效果越好。

整个染色液配制时间不能少于整个染色液配制时间不能少于55个小时个小时血片的染色血片的染色染色用水和冲洗用水配制u常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水u用pH7.0pH7.2的缓冲液。

血片染色薄血膜的固定薄血膜的固定u厚血膜充分干燥,用甲醇固定薄血膜，平放待干（要点：

甲醇不能触碰到厚血膜）u操作操作11（快染）（快染）量筒内量筒内量量2ml2ml缓冲液缓冲液（PBSPH7.0）（PBSPH7.0）或净水，直接滴加吉氏原或净水，直接滴加吉氏原液液77滴，混匀，滴入待染标滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色本的厚薄血膜上，染色10min10min，清水缓缓冲洗，晾，清水缓缓冲洗，晾干干（血膜朝内面）（血膜朝内面）镜检。

镜检。

u操作操作2（2（慢染慢染）量筒量筒内量内量2ml2ml缓冲液或净水，缓冲液或净水，再滴加吉氏原液再滴加吉氏原液44滴，混匀，滴，混匀，滴入待染标本上，染色滴入待染标本上，染色30min30min。

清水缓缓冲洗，晾。

清水缓缓冲洗，晾干镜检。

干镜检。

血片染色将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液（3毫升吉氏染色液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，染色30分钟。

（如染液稀释液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将染色片插于晾干板上晾干，包装，待镜检。

u成批血片染色厚血膜溶血染色放置多时未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，须在厚血膜上用清水进行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分钟。

然后用清水漂洗干净,晾干。

质量好的染色质量好的染色显微镜下核呈红色显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列如果血片偏红如果血片偏红,说明染液偏酸性说明染液偏酸性如果血片偏蓝如果血片偏蓝,说明染液偏硷性说明染液偏硷性外观吉氏染色血片偏酸偏碱标准配置完吉氏原液时必须过滤除去杂质颗粒，有助配置完吉氏原液时必须过滤除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量于提高镜检质量；染液稀释后使用时间：

染液稀释后使用时间：

原液必须临用时稀释，随原液必须临用时稀释，随配随用；配随用；染液的稀释浓度；染液的稀释浓度；染色时间。

染色时间。

染色质量影响因素染色质量影响因素l用水过酸，用水过酸，可致感可致感染的染的RBCRBC上的点彩上的点彩染不出来；染不出来；l用水过碱，用水过碱，则使薄则使薄血膜上的血膜上的RBCRBC染成染成灰蓝色，致使灰蓝色，致使RR的的胞浆难以辨论。

胞浆难以辨论。

染色染色稀释稀释用水用水:

PH7.0-7.2清洁水清洁水。

染色质量影响因素染色质量影响因素固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜；固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜；血膜在制备后应尽量能在当天染色，一般夏血膜在制备后应尽量能在当天染色，一般夏天不超过天不超过4848小时，冬天也不能超过小时，冬天也不能超过7272小时小时,放置放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。

时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。

染色质量影响因素染色质量影响因素疟原虫镜检疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点疟原虫密度计数方法人体四种疟原虫的形态特征当前分子生物学、血清学技术快速发展当前分子生物学、血清学技术快速发展,但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替代的确诊疟疾的代的确诊疟疾的“金标准金标准”显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴别别44种人体疟原虫种人体疟原虫原虫镜检-金标准疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点厚血膜薄血膜优点优点血量多，面积小，血量多，面积小，原虫原虫检出率高检出率高经甲醇固定，红细胞完经甲醇固定，红细胞完整，原虫形态改变不大，整，原虫形态改变不大，原虫易于辨认原虫易于辨认缺点缺点原虫在干燥过程中皱缩，原虫在干燥过程中皱缩，红细胞消失，原虫变形较红细胞消失，原虫变形较大，大，原虫鉴定困难原虫鉴定困难血量比厚血膜少许多，血量比厚血膜少许多，但面积是厚血膜的但面积是厚血膜的8-108-10倍。

检查费时，倍。

检查费时，原虫检原虫检出率较低出率较低用途用途用于疟疾病人检查用于疟疾病人检查原虫虫种、虫期鉴定及原虫虫种、虫期鉴定及初学者教学标本初学者教学标本疟原虫密度计算疟原虫密度计算计算疟原虫密度的三种方法：

计算疟原虫密度的三种方法：

白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法（厚血膜厚血膜WHO）WHO）优点：

可作为定性和定量分析优点：

可作为定性和定量分析半定量计数法半定量计数法（厚血膜厚血膜）优点：

方法简便优点：

方法简便缺点：

只能定性，不宜作为定量分析缺点：

只能定性，不宜作为定量分析红细胞感染密度计算法红细胞感染密度计算法（薄血膜薄血膜）白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法镜检厚血膜，按视野顺序，记录镜检厚血膜，按视野顺序，记录200200个白细胞中的个白细胞中的疟原虫数，如果原虫密度较低（疟原虫数，如果原虫密度较低（200200个白细胞中小个白细胞中小于于100100个疟原虫），可增加白细胞，计数个疟原虫），可增加白细胞，计数500500个。

个。

密度单位密度单位:

原虫数原虫数/l/l计算公式：

疟原虫数计算公式：

疟原虫数计数的白细胞数计数的白细胞数患者患者每微升血白细胞数每微升血白细胞数=疟原虫数疟原虫数/l/l血。

血。

如果不知患者的白细胞数，则每微升血以如果不知患者的白细胞数，则每微升血以80008000个个白细胞计数白细胞计数（国际标准国际标准）。

白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法从血膜的左上角开始，横向。

从血膜的左上角开始，横向。

计数计数11个视野后，每次间隔个视野后，每次间隔55个视野个视野,再计数。

再计数。

厚血膜厚血膜不需要计数的视野需要进行白细胞、疟原虫计数的视野如果该视野无原虫，则计数白细胞数看到第一个原虫开始计数白细胞原虫密度计数方法白细胞疟原虫计数法白细胞疟原虫计数法例如例如计数计数200WBC200WBC中有中有135135个疟原虫，在不知患个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血者白细胞数的情况下，以每微升血80008000个白细个白细胞计数胞计数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为由此计算出每微升血液疟原虫密度为：

135（计数的疟原虫数）200（计数的白细胞）x8000（每微升血白细胞数）=5400/l答：

该患者的疟原虫密度为5400/l。

用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估算出疟原虫密度。

此方法将密度分为6级：

1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”3.平均每个视野15个虫，记录“”4.平均每个视野610个虫，记录“+”5.平均每个视野11100个虫，记录“+”6.平均每个视野100个虫以上，记录“+”。

如：

PvR+T+S5G少这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。

半定量计数法如何确定疟原虫血片为阴性检查全部厚血膜视野未查见疟原虫最少检查100个厚血膜视野未查见疟原虫（临床病人）人体四种疟原虫的