微生物工程及设备复习资料Word下载.docx
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将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内及属间）融合为一个新细胞的技术。
即实现遗传重组。
准性生殖：
3常用诱变剂：
物理诱变剂、化学诱变剂（碱基类似物，与碱基反应的物质、在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基）、生物诱变剂（噬菌体，转座子）。
4.诱变育种的基本过程：
选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大培养
P53.（选择）
5.（大题）诱变育种的基本方法：
1）出发菌株选择一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。
菌株来源是从自然界中分离得到的野生型菌株；
通过生产选育，即由自发突变经筛选得到的高产菌株；
已经诱变过的菌株。
其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。
2）制备菌悬液：
待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。
一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。
悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。
菌悬液的细胞浓度一般控制为：
真菌孢子或酵母细胞106107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。
菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。
3）诱变处理：
诱变剂剂量选择：
在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。
不同微生物，使用的剂量不同；
诱变率随诱变剂剂量的增加而提高。
但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。
诱变剂使用：
单一诱变剂处理；
复合诱变剂处理
6（大题）原生体的融合技术一般步骤：
选择亲株、原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤。
（常用的试剂）
方法：
1）选择亲株：
选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。
为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等
2）原生质体制备：
去除细胞壁是制备原生质体的关键。
培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。
在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。
在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。
菌龄：
对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。
一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。
3）原生质体融合：
聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合。
一般PEG的使用浓度范围在25-40%。
采用电融合仪：
在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合。
4）原生质体再生：
使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。
不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压。
5）融合重组子的筛选：
通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。
如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。
7.基因工程技术的主要步骤
基因工程技术：
将一个含有目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，并转入一受体细胞（通常多为细菌），使之扩增、表达的操作过程。
一般过程方法：
含目的基因的DNA片段的准备；
载体；
含目的基因的DNA片段与载体相连接；
将重组分子送入受体细胞，并于其中复制、扩增；
筛选出带有重组DNA的转化细胞；
鉴定外源基因的表达产物
五、菌种的保藏的方法（原理：
P78选择题）
1．斜面低温保藏法：
将菌株接种于合适斜面培养基上，而后置于4℃冰箱保藏，每隔一定时间进行移接培养后再将新斜面继续保藏。
这种保藏方法简单，存活率高，易于推广，经常使用的菌种可采用这种方法。
其缺点是菌种仍有一定强度的代谢活动条件，保存时间不长，而且传代多，因此菌种客易产生变异。
2、液体石蜡保藏法：
将生长好的新鲜斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层要高出斜面上端1cm，使之与空气隔绝，然后垂直放于室温或冰箱内保藏即可。
这种方法也比较简便，且保藏时间一般可长达l年以上。
适于保存部分霉菌、酵母菌、放线菌，但对细菌效果较差，对某些能同化烃类的微生物则不适用。
3、砂土管保藏法：
将孢子悬浮液转移至灭过菌的砂土管中，于真空干燥器内用真空泵抽干，再转至有干燥剂的容器中，密封低温保藏。
该法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。
适用于细菌的芽孢、霉菌和放线菌孢子的保藏，不适于对干燥敏感的无芽孢的细菌和酵母菌。
主要包括砂土管制备和真空抽干两步。
4、真空冷冻干燥保藏法：
在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。
这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异和死亡，可长期保存，一般为5~10年。
微生物在此条件下易死亡，所以需加入一些物质作保护剂，一般常用的是脱脂牛奶、血清等。
该法存活率高，变异率低，并能广泛适用于细菌（有芽孢和无芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放线菌孢子和病毒等，因此是目前广泛采用的好方法。
其缺点是手续麻烦，操作复杂，要求严格，并需有一定设备条件。
5、液氮超低温保藏法：
适用范围最广的超低温保藏法。
其原理是液氮的温度可达-196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（-130℃），此时，菌种的代谢活动停止，化学作用亦随之消失。
注意点：
安瓿管是否完好、冷冻的速度、液氮的添加
6、悬液保藏法：
即寡营养保藏，将微生物悬浮在不含养分的溶液中，如蒸馏水等。
保藏的关键：
试管密封好，以防水分蒸发。
7、低温保藏法：
多数微生物可在-20℃以下的低温中保藏。
注意：
融化后的菌种不能再用低温保存，要重新移种后再冷藏。
保藏方法
斜面冰箱保藏法4℃；
3-6个月
沙土管保藏法产孢子或芽孢微生物，1年
菌丝速冻法甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20℃
石蜡油封存法1年左右
真空冷冻干燥保藏法任何微生物；
一般5年以上
液氮超低温保藏法-196℃；
保护剂；
保存期长
六、培养基
1.培养基的类型：
根据来源不同，分为：
天然培养基：
采用化学成分不清楚或化学成分不恒定的各种动植物或微生物的浸出物、水解液等物质制成的。
合成培养基：
用化学成分和数量完全了解的物质配制而成，成分精确，重复性强，可减少不能控制因素。
半合成培养基：
既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。
根据物理性状不同，分为：
液体培养基，固体培养基，半固体培养基
根据主要成分和使用目的，分为：
基础培养基
增殖培养基
鉴别培养基：
培养基中加有能与某一菌的无色代谢物发生显色反应的指示剂。
选择培养基：
根据某生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。
根据生产工艺的要求，分为：
孢子培养基，种子培养基，发酵培养基。
种子培养基：
满足菌种生长用的。
营养丰富，氮源、维生素比例较高。
发酵培养基：
满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累的营养物质。
2微生物培养基的成分（常用的种类，作用，类型）：
碳源，氮源，无机盐，微量元素，生长因子，促进剂和抑制剂，前体和水。
3常用碳源：
糖类、脂类、有机酸、低碳醇。
糖类：
葡萄糖（纯葡萄糖、水解淀粉），乳糖（纯乳糖、乳清粉），淀粉（大麦、花生粉、燕麦粉、黑麦粉、大豆粉等），糖蜜（甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖等）
脂类如各种植物油和动物油也能被许多微生物用作碳源和能源。
有机酸：
如乳酸，醋酸，柠檬酸，延胡索酸等
3.氮源：
分为无机氮源和有机氮源
1）无机氮源：
种类：
铵盐、硝酸盐和氨水。
特点：
微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。
但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。
选择合适的无机氮源的意义：
满足菌体生长，稳定和调节发酵过程中的pH
2）有机氮源：
工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。
除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。
如：
玉米浆含有①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸；
②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等
有机氮源成分复杂，可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。
所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。
使用注意：
有机氮源和无机氮源应当混合使用；
早期：
容易利用易同化的氮源—无机氮源；
中期：
菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质。
有些产物会受氮源的诱导和阻遏。
4.无机盐：
磷酸盐、硫酸镁、钾盐、微量元素（锰、铁）等。
来源：
C、N源，以盐的形式补充；
使用注意点：
对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑；
使用时注意盐的形式（pH的变化）。
5,。
名词解释：
前体：
某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入而有较大的提高。
产物促进剂：
那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
抑制剂：
可以抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。
6.培养基的优化
培养基设计与优化的大致步骤：
1）根据前人的经验和培养基配制的基本理论，初步确定可能的成分；
2）通过单因子实验确定最为适宜的培养基成分；
3）通过多因子实验确定各成分的最适浓度
正交实验设计
步骤：
1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；
2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验；
3）根据正交表给出的实验方案，进行实验；
4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。
七、发酵工艺的控制
1温度对发酵的影响及其控制
1）温度对微生物生长的影响
生物体的生命活动可以看作是相互连续进行酶反应的表现，任何化学反应又都和温度有关。
所以温度直接影响酶反应，从而影响着生物体的生命活动。
每种微生物各有其生长发育所需的温度。
在最适温度范围内，生长速度随温度升高而增加，发酵温度升高，生长周期就缩短。
不同生长阶段的微生物对温度的反应则不同。
2）温度对产物形成的影响
许多产物的形成速率对温度都很敏感。
3）温度影响发酵液的物理性质
如温度可影响氧在发酵液中的溶解度，影响基质的分解速率等。
从而间接影响了微生物的生物合成。
4）温度影响生物合成的方向
如金色链丝菌在低于30℃时，合成金霉素的能力强，在高于35℃时，合成四环素的能力非常强，金霉素的合成几乎停止。
2.生物热（名词解释）：
生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。
培养基中碳水化合物，脂肪，蛋白质等物质被分解为CO2和NH3时释放出的大量能量。
用途：
合成高能化合物，供微生物生命代谢活动，热能散发。
影响生物热的因素：
生物热随菌株，培养基，发酵时期的不同而不同。
还与菌体的呼吸强度有对应关系。
3.搅拌热（名词解释）：
搅拌器的机械搅拌的动能以摩擦放热的方式使热量散发在发酵液中。
4.蒸发热（名词解释）：
通入发酵罐的空气，其温度和湿度随季节及控制条件的不同而有所变化。
空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换。
同时必然会引起水分的蒸发；
蒸发所需的热量即为蒸发热。
5.发酵热（名词解释）：
生理酸性物质：
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺；
生理碱性物质：
菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。
6.pH对发酵的影响：
（发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数。
它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。
因此，必须掌握发酵过程中pH的变化规律，及时监测并加以控制，使它处于最佳的状态。
尽管多数微生物能在3~4个pH单位的pH范围内生长，但是在发酵工艺中，为了达到高生长速率和最佳产物形成，必须使pH在很窄的范围内保持恒定。
）
pH影响酶的活性。
当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻。
pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。
pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。
pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。
7.影响发酵pH的因素
1）发酵过程中pH的变化：
生长阶段：
此时，微生物调节培养基pH的能力惊人，所以培养开始时发酵液pH的影响是不大的。
生成阶段：
某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。
如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。
自溶阶段：
pH上升，发酵后期，pH上升。
2）引起pH下降的因素：
碳源过量：
特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。
消泡剂添加过量。
生理酸性物质的存在
3）引起pH上升的因素：
氮源过多：
无机/有机氮源的代谢起到提高pH的作用。
生理碱性物质的存在。
中间补料，碱性物质添加过多。
当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升，是补料的标志之一。
8.临界溶氧浓度（名词解释）：
CCr指在好氧发酵中，满足微生物呼吸的最低氧浓度。
9气液相间的氧传递和传质方程式
稳定状态下，氧分子从气体扩散到液体主体的传递速率为：
10.摄氧率（r）（名词解释）：
单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。
mmolO2·
L-1·
h-1。
11.r=QO2.X（X：
细胞浓度）
呼吸强度（QO2）：
用来描述微生物的耗氧速度，指单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，mmolO2·
g菌-1·
h-1
12.溶氧浓度控制（溶氧对发酵的影响，对溶氧调节的方法）：
1）从供氧方面考虑：
从氧传递动力学方程式，可以看出：
在供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力（c*-cL）和体积氧传递系数KLa。
（1）提高kLa：
kLa反映了设备的供氧能力，不但与反应器的结构参数有关，还与发酵液的性质有关（粘度、浓度等）
搅拌转速：
kLa∝（Pg/V）α×
VsвPg∝N2.46。
可见，提高N可以有效的提高kLa，从而增加发酵液中的溶氧浓度。
但是，高转速也有不利的方面（能耗、菌体对剪切力的要求）。
Vs-空气流速：
由公式kLa∝（Pg/V）×
Vs可知，提高Vs即提高通风量Q也可以有效的提高kLa。
但不能够无限的增加通风量,研究表明，当通风量增加到一定的量后，（Pg/V）会随着Q的增加而下降。
也就是说单位体积发酵液所拥有的搅拌功率会下降，不但不能提高kLa，甚至会造成kLa值的下降。
可见，提高KLa最有效的方法是提高N与Vs，并协调两者之间的关系，其他方法效果不大，且受限制较多。
（2）提高（c*-cL），即氧传递动力：
c*，改变c*是没有太大的余地的。
因为，发酵温度、浓度等严格的受到菌体生长和发酵工艺的限制。
提高罐压：
Pi增加则与之平衡的Ci也会增加，对提高（c*-c）是有一定作用的。
利用纯氧，可以提高（c*-cL）。
缺点：
价格较高，易引起爆炸
⑤消沫剂：
加入消沫剂，分布在气液界面，增大了传递阻力，使KL下降。
使用的消沫剂是表面活性物质，尽管会引起溶解氧浓度的暂时下降，但最终会改善发酵液的通气效率。
⑥离子强度：
电解质溶液中的气泡比在水中的要小，所以有较大的比表面积。
因此同样条件下，电解质溶液的KLα值也比水中的大。
⑦影响推动力的因素：
如温度、电解质溶液等。
2）从耗氧方面考虑：
摄氧速率：
r=QO2.X
X：
菌体浓度
QO2：
遗传因子、菌龄、营养成分与浓度、有害物质的积累、培养条件。
13.发酵过程泡沫产生的原因
（1）通气搅拌的强烈程度：
通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。
应先开小通气量，再逐步加大。
搅拌转速也如此。
也可在基础料中加入消泡剂。
（2）培养基配比与原料组成：
培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。
（3）菌种、种子质量和接种量：
菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。
菌种生长慢的可以加大接种量
（4）灭菌质量：
培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。
14.泡沫对发酵的危害
1）降低发酵设备的利用率2）增加了菌群的非均一性3）增加了染菌的机会4）导致产物的损失5）消泡剂会给后面的提取工序带来困难6）泡沫中的代谢气体不易被带走，改变了生活环境，使菌体代谢异常，导致菌体提前自溶
15.影响泡沫稳定性的因素
泡径大小2）溶液所含助泡物的类型和浓度3）起泡液的粘度4）其它温度，pH，表面电荷。
16.泡沫的控制方法：
1）物理消沫法2）化学消沫法3）减少培养基中易起泡的成分4）减少培养基中粘度大的成分5）适当减少通气量及搅拌转速
物理消泡法：
原理：
靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。
罐内消沫法，最简单的就是在搅拌轴上部安装消沫浆。
罐外消沫法，将泡沫引出罐外，消泡后，液体再返回罐内。
优点：
不需要引进外界物质、节省原材料、减少污染机会。
不能从根本众消除引起稳定泡沫的因素。
化学消泡法：
机理：
当泡沫的表层存在着由极性的表面活性物质形成双电层时，可以加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强曲或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺液膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破裂。
当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。
15.常用消泡剂：
天然油脂、聚醚类、高级醇、硅酮类、脂肪酸、亚硫酸、磺酸盐。
其中最多的是天然油脂和聚醚类。
天然油脂：
常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、鱼油及猪油等。
聚醚类：
在生产上应用较多的是聚氧丙烯甘油（GP）和聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE）。
它们以一定比例配置的消泡剂又称为泡敌。
高级醇类：
十八醇是较常用的一种，可以单独或与载体一起使用。
据报导，它与冷榨猪油一起控制青霉素发酵的泡沫，效果较好。
聚二醇具有消沫效果持久的特点，尤其适用于霉菌发酵。
硅酮类：
主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。
适用于微碱的细菌发酵液。
8、发酵过程参数检测和自动控制
*补料的内容和策略
*发酵过程中杂菌污染与控制
1.发酵参数分类
1）按参数性质分
物理参数：
温度、搅拌转速、压力、空气流量、表观粘度等
化学参数：
基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量、溶解氧、溶解二氧化碳、排气O2和CO2浓度等
生物参数：
菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等
2）按检测手段分
直接参数：
能反映过程中菌体的生理代谢状况的参数，可通过传感器等测量仪器直接测量。
在线检测参数：
指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；
离线检测参数：
指取出样后测定得到的参数，如残糖、菌体浓度。
间接参数：
不能直接测量的，需根据基本参数通过计算求得的参数，如摄氧量、体积溶氧系数等
2.温度（物理参数）：
指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。
温度的高低与下列参数有密切关系：
发酵中的酶反应速度，菌体生长速度，产物合成速度，氧在培养液中的溶解度，传递速度
温度传感器：
常用的有热电阻（铂电阻和铜电阻）、热电耦、双金属片
3.pH（化学参数）：
发酵过程中各种产酸，产碱生化反应的综合结果，与菌体生长和产物合成有重要的关系。
pH的高低与菌体生长和产物合成有着重要的关系。
pH电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电池。
该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。
因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数。
复合电极：
将两支电极都装在一根玻璃管中，这种电极叫复合电极，工业上在线检测大都使用这种电极。
它结构紧凑，便于安装。
4.菌体浓度：
菌体浓度的大小和变化速度对生化反应有影响，特别是对抗生素等次级代谢产物的发酵，菌体浓度与培养液的粘度，DO都有关。
细胞浓度的测量：
化学法：
如DNA、RNA分析等。
物理法：
如重量分析、分光光度分析、浊度分析等。
新技术：
以电容法为测量原理的在线活细胞浓度测量传感器。
常用流通式浊度计，其原理是使发酵罐中的发酵液进入一流通式薄层比色杯，用波长500~600nm的光束测量发酵液的光密度，然后发酵液再返回发酵罐中，所测度的OD值与细胞浓度成线性关系。
5名词解释：
呼吸商RQ：
发酵过程中二氧化碳生成比速与氧的消耗比速的商。
摄氧率OUR：
菌体细胞氧的吸收率，就是单位体积培养液在单位时间内所消耗的氧量
CO2释放率（CER）：
单位体积发酵液在单位时间内产生的CO2量
9、微生物反应动力学
1.类型Ⅰ（生长相关型）：
菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰
菌体生长类型：
终产物就是菌体本身，菌体增加与碳源利用平行。
如酵母、蘑菇菌丝等。
代谢产物类型：
产物是碳源的直接氧化产物。
产物积累与菌体增长相平行。
如酒精、乳酸等。
2.类型Ⅱ（生长部分相关型）：
微生物生长与
升级会员 