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3.菌种扩大培养的目的和意义是什么？
（1）提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。
目的是：
a、缩短发酵周期，降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的）b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。
（2）让菌种从固体试管、液体试管、三角瓶、种子罐、发酵罐逐级扩大，逐步适应大环境的生产。
（3）菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象。
通过连续的扩大培养，每一级都要进行严格的检查，对于不合格的严禁使用，增加了生产的可靠性。
4.工业生产用菌种的基本要求有什么？
（1）具有稳定的遗传学特性
（2）微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求
（3）生长条件易于满足（“临界溶氧浓度”pH值等）
（4）对于细菌，希望具有抗噬菌体的能力。
（5）具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率和反应速度，进而可以缩短发酵周期，降低生产成本。
（6）对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。
对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎；
对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎时不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。
5.微生物发酵常用的菌种有哪些？
1.细菌类：
「短杆菌：
GA,GIn,lys
枯草芽抱杆菌：
淀粉酶（BF7658、碱性蛋白酶等
J地衣芽抱杆菌：
HASS耐高温a-淀粉酶）a-Amylase苏云金芽抱杆菌：
BT生物农药……
.梭状芽抱杆菌：
丙酮、丁酸等的发酵
2.酵母菌•啤酒酵母：
酿酒酵母、辅酶类物质的发酵
I酒精酵母：
"
汉逊酵母：
食品工业，用于乙酸乙酯的发酵
I假丝酵母：
scp生产，石油发酵
3.霉菌.黑曲霉：
柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、酶制剂工业（糖化酶）
黄曲霉：
酱油生产（3042），面酱
J青霉菌：
青霉素的生产
十红曲霉：
红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；
使用红色色素的生产；
豆腐乳的生产等
赤霉菌：
赤霉素的生产，是一种植物生长激素
4.放线菌：
各种抗生素，链、土、庆大等
第三章
1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？
（1、淀粉及其水解糖液
（2、含有淀粉及其水解产物的废弃物：
味精废水、粉丝生产废水等
（3、化工石油产品：
醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等
4）纤维素
2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？
1无机氮源：
氨水、尿素（有脲酶微生物）、（NH4）2S04NH4NO3NH4CL等
2有机氮源:
豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、菌体蛋白、玉米蛋白粉等
3.淀粉的水解方法主要有什么？
试进行优缺点比较？
酸法水解的主要副产物是什么？
淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法。
酸法：
（优）生产方法简单易行；
对设备要求简单；
水解时间短；
生产能力大。
（缺）反应条件比较强烈；
产生的副产物较多。
双酶法：
（1）酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的生长有利。
双酶法淀粉水解首先使用耐高温a-淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖很少，不具备生成副产物的物质条件。
（2）淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可以提高10%以上。
（3）可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条件温和，对于粮食中的蛋白质等其他物质的破坏较少。
（4）双酶法水解使用的淀粉乳浓度较高，可以达到20Be以上，而采用酸法水解，淀粉乳的浓度通常只有12Be。
酸法水解的主要副产物：
（1）双分子葡萄糖脱水，形成复合二糖，分别是异麦芽糖、龙胆二糖。
前者不利于产物的结晶提出；
后者对于菌体的生长有抑制作用。
（2）一分子葡萄糖脱水，形成5-羟甲基糠醛，对于菌体的生长有抑制作用。
（3）一分子葡萄糖和-NH2反应，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。
4.双酶法淀粉的水解通常使用哪2种酶？
其作用特点分别是什么？
a-淀粉酶：
又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉a-1，4葡萄糖苷键，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精，其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之，该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖，因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。
淀粉a-1，4；
1，6葡萄糖苷酶：
又称糖化酶，可以水解淀粉分子的a-1，4或a-1，6葡萄糖苷键，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。
5.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？
灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。
灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢，在工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌。
借助蒸汽释放的热能使微生物细胞内蛋白质、酶、核酸分子内部的化学键特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，致使微生物死亡。
在有水分存在的情况下蛋白质更易受热而凝固变性。
湿热灭菌的显著优点是：
使用方便，无污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。
理论灭菌时间：
t=2.303/k*lnN0/NS
实际生产中：
间歇灭菌：
121C20-30min
连续灭菌：
137C15-30S在维持罐中保温8-20min
6.生物反应器灭菌的操作要点有什么？
将配置好培养基打入生物反应器内进行实消，操作要点如下：
（1）定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：
冷却管道，夹套。
（2）培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气，当培养基的温度升到灭菌温度时，
进入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道处于两个状态：
进汽或出汽，目的是
对管道进行灭菌。
（3）培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到100C时，停
止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基的温度升温到100C时，培养基的沸
腾，可以起到搅拌作用。
（4）注意辅助设备的灭菌：
空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。
（5）保温期间，要求罐压：
0.09—0.10MPa,温度：
118—121C，时间：
30分钟。
（6）灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。
（7）配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌时的稀释（体积的增加），通常体积可增加20%左右，灭菌时间越长，体积增加的越多。
7•以化学反应动力学为基础，说明高温短时灭菌可以减少培养基营养成分损失的原因。
培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应，
对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大
小）却不同，其比值可以表示为：
Ig（k2/k1）/lg（k,2/k,1）=E/E,……（5）
实验证明：
营养成分为破坏的反应的活化能E的值为
E,=8.36—83.6*103J/mol
而菌体死亡的活化能E
厂芽孢：
E=418*103J/mol
E=Y
*无芽孢：
E=209—250*103J/mol
显然，（5）式的比值〉1,说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。
提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所
需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常数增加的少，因此,
有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。
换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成
分是有利的。
8•掌握以下几个概念：
理论灭菌时间：
理论计算中培养基的灭菌过程所用的时间t=2.303/k*lnNo/Ns
式中——N0,NS:
分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml）
--k:
表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数
对数残留定律：
即微生物的热致死规律，在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论，在微生物受热失活的过程中，微生物不断被杀死，活菌数不断减少，其减少速度随活菌残量的减少而降低。
一dN/dt=K*N
实消：
将配置好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程。
优点：
不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。
空消：
在生物反应器内没有物质时对其进行灭菌。
意义：
由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。
采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消。
连消:
将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。
优点:
营养成分破坏少，生产效率高；
热综合利用率高；
大型企业自动化程度高。
第四章
1.基本概念：
能荷：
生物体所具有的能量水平。
能荷=（[ATP]+1/2[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）显然，能荷在0—1之间。
甘油发酵：
在厌氧或好氧条件下培养酵母，利用糖分解生成甘油的过程。
侧系呼吸链：
NAD（P）H经过该呼吸链，可正常传递H+,将其氧化为H2Q但是并没有氧化磷酸化生成ATP,不能够正常产生ATP的呼吸链称之为侧系呼吸链。
标准呼吸链：
NAD（P）H经过该呼吸链，可正常传递H+,将其氧化为H2Q并能正常氧化磷酸化生成ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。
二氧化碳固定化反应：
二氧化碳在酶的作用下转化为还原性有机化合物的过程初级代谢：
是指微生物合成它们生长所必需的物质的诸如：
糖、氨基酸等以及由这些化合物形成的高分子物质如：
多糖、蛋白质、核酸等的代谢，称之为初级代谢。
那么，这些化合物统称之为：
初级代谢产物。
次级代谢：
是指微生物在生长后期进行的与他们的生长无明显关系的代谢，这一类的物质统
称之为：
次级代谢产物。
例如：
抗生素、激素、某些酶制剂等。
分叉中间体：
处于代谢的分叉点上，既可以合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物，把微生物的初级代谢和次级代谢紧密联系起来的物质。
发酵逆转：
发酵中期当微生物群体进入产物合成期时，如果向发酵液中流加氮源或碳源或改变发酵条件，使微生物群体返回到生长期而停止产物的合成，这种现象称之为发酵逆转。
反馈抑制：
是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。
协同反馈抑制：
就是该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。
营养缺陷型：
某些菌株发生突变后，失去合成某些对该菌株生长必不可少的物质的能力，必
须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。
抗性突变株：
是指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。
分解代谢阻遏：
当培养基中同时存在多种可供利用的底物时，分解利用某些底物的酶往往被最容易利用的底物所阻遏。
又称之为葡萄糖效应。
代谢控制发酵：
是指利用生物的、物理的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代谢途径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。
DCA循环：
在异柠檬酸裂解酶的催化下，异柠檬酸被直接分解为乙醛酸，乙醛酸又在乙酰辅
酶A参与下，由苹果酸合成酶催化生成苹果酸，苹果酸再氧化脱氢生成草酰乙酸的过程。
2.厌氧甘油发酵和好氧甘油发酵的优缺点比较。
甘油厌氧发酵的缺点：
a.菌体死亡率较高，碱性条件；
无能量产生；
b.转化率较低，实际转化率远低于50%
c.由于残糖的存在，导致甘油的提出率更低。
（我们国家没有超过70%）
好氧发酵：
优点：
在适当（或者说有限的好氧）好氧的条件下，酵母细胞进行有限的好氧呼吸，糖酵解产生的丙酮酸可以通过TCA循环来增加其产能水平，一方面减少3—磷酸甘油醛向乙醛方
向进行，增加底物向产物转化的比例；
另一方面，增加了细胞能量水平，减少了细胞的死亡
率，有利于提高发酵的速率，缩短发酵周期。
缺点:
这种有限的好氧发酵，使得丙酮酸进行TCA循环的同时，也增加了TCA循环过程中
的许多中间性产物的产生，这对于甘油的提取带来了不利的影响。
3.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？
C6H12Q
（1）点：
EMP畅通无阻①控制MHnH浓度，解除柠檬酸对PFK
的抑制②控制溶氧，防止侧系呼吸链失活
丙酮酸+丙酮酸
（2）点：
通过CO固定反应生成G二羧酸，强化这一反应的方
和法：
添加辅酶生物素
乙酰辅酶A+C4二羧酸
（3）点：
柠檬酸后述的酶的酶活性丧失或很低，控制培养基卄中的Fe2+的浓度
柠檬酸
4.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。
在柠檬酸产生菌体内存在一条侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20分钟，根据处理情况如：
紧急保压等）。
则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体，因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP用于菌体自身的生长上，这种现象在生产上通常称之为：
只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败。
5.简述二氧化碳固定反映对于提高柠檬酸产率的意义。
葡萄糖经过EMP途径生成丙酮酸后，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成了乙酰辅酶A（CH3CO-CoA）则合成一分子柠檬酸需要3分子的CH3CO-CQA也就是需要1.5分子的葡萄糖；
如果其中一分子的丙酮酸通过CO2固定反应生成一分子的C4二羧酸，那么合成一分子的柠檬酸需要1分子的葡萄糖，产率可以大大的提高。
6.比较细菌发酵和酵母发酵的优缺点
（1）细菌菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产率高。
（2）细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。
（3）细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，GA的发酵；
对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。
（4）对于细菌的诱变与选育手段多，改变细菌的遗传特性很容易，对酵母菌的诱变需剥离开细胞壁与细胞膜。
（1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出，或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。
（2）细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。
（3）细菌发酵易感染噬菌体。
7.写出大肠杆菌中Lys代谢途径，说明利用大肠杆菌发酵生产Lys
的菌种特性和控制要点。
Glucose
EMP
丙酮酸
草酰乙酸
Asp*
（天冬氨酸激酶AK同功酶）
Lys
天冬氨酸B-半醛
羟吡啶羧酸
（同功酶）
天冬氨酸磷酸（asp-p）
MetThr
大肠杆菌赖氨酸代谢特点：
天冬氨酸激酶是一个关键酶，分别受三个代谢产物的抑制，
这三个终产物分别是：
Lys、Met和Thr，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp激酶的活
性才能完全被抑制。
控制要点：
要使菌体合成并积累Lys，可以选育Hos，这样的话，既可以解除天冬氨
酸的代谢支路，使代谢流向Lys的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率；
更重要
的是由于Hos，使得代谢过程中不可能产生过量的Met、Thr，尽管产生了大量的Lys，Lys
可以抑制关键酶一一天冬氨酸激酶1但是天冬氨酸激酶2、3的活性由于Met、Thr的限量，并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸半醛，仍可以大量的生成，这就保证了Lys的
生物合成途径的畅通无阻。
8.
Lys的菌种
写出黄色短杆菌中Lys代谢途径，说明利用黄色短杆菌发酵生产特性和控制要点。
EMPj
天冬氨酸磷酸（asp-p）
高丝氨酸
a
珀酰高丝氨酸
O礪酸高丝氨酸
Met
Thr
特点：
（1）天冬氨酸激酶（AK）,在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr的协同反馈抑制。
（2）黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制，如图所示（）,即优先合成Hos,
然后再优先合成Met，当Met过量时，阻遏：
催化Hos琥珀酰高丝氨酸所需要的酶的合
成（即，琥珀酰高丝氨酸合成酶），使代谢流向合成Thr的方向进行，当Thr过量时，反馈抑制：
Asp-3-半醛Hos所需要的酶的的活性（即高丝氨酸脱氢酶），使代谢流向Lys的
合成上。
根据以上代谢特点，利用黄色短杆菌生产Lys，需要选用Hos-,尽管，从理论上
讲，选育Hos-进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr,则AK酶的活性不会受到
Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用。
因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hos-是不够的但是为了高效率的转化Lys，可以选育结构类似物抗性突变株：
（1）S-L-半胱氨酸抗性突变株AECr
（2）丫-甲基赖氨酸抗性突变株MLr（3）L-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株LysHxr（4）苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株ThrHxr
使用黄色短杆菌进行赖氨酸的发酵，还可以选育具有双重标记的营养缺陷型突变株（Met-+Thr-）,其本质上和Hos-是一样的，但双重标记的营养缺陷型突变株的优点是：
遗传性质稳定，恢复突变的几率少。
9.谷氨酸发酵生产过程中，主要出现哪些异常现象？
其危害是什么？
产生的原因是什么？
如何处理？
1.发酵前期pH值过高危害：
影响菌体正常生长；
发酵周期延长；
成本增加；
易发生菌体自溶。
影响因素：
（1）耗糖速度过慢（就是糖的代谢速度过慢）
（2）初脲量大，菌种脲酶活力高导致铵离子浓度高
（3）感染phage
（4）培养基中缺乏磷酸盐等
处理方法：
（1）耗氧速度慢，通过测定糖的含量确定，可以强化通风，适当添加生物素等
（2）初脲量大，停止通风，或者小通风，以使尿素缓慢释放铵离子
（4）缺乏磷酸盐
2.初期pH值偏低
危害：
影响因素及处理方法：
（1）初脲添加量不够，提前酌情流加尿素
（2）泡尿
（3）培养基中的磷酸盐过高，代谢平衡被打破，酸性产物的积累
（4）供氧不足通风量搅拌转速发酵罐压力
结构参数（挡板空气分布器搅拌桨形式）
3.接种后菌体生长不良，ODf直偏低，耗糖速度减慢
发酵周期长；
菌体活力低；
核酸转化率偏低
原因：
（1）可能感染phage
（2）培养基存在问题：
缺乏磷酸盐、缺乏生物素、存在抑制菌体生长的物质
培养基灭菌产生的抑制性物质
（3）通风量过大，溶氧水平高。
使得菌体耗糖速度降低
（4）种子不良，种子衰老，接种温度过高导致菌体被烫死
（5）前期通风较少，pH值偏低，代谢产物积累较多的酸性物质，不利于菌体的生长
4•中后期，ODf直继续升高，耗糖快，但是产酸很低
只长菌不产酸
（1）生物素浓度过高
（2）感染杂菌，可通过镜检初步判断是否感染杂菌
5.发酵中后期pH值偏低，耗糖快，但是产酸低或不产酸
（1）感染杂菌
（2）供氧不足，导致酸性产物的积累
（3）生物素浓度过高，磷酸盐浓度过高，导致OD直增长太快
大量的通风、提前流加尿素
6.发酵过程中发酵液泡沫太多
（1）淀粉质量差，杂质多，蛋白质含量高
（2）糖化不完全，糖化液中含有糊精
（3）糖化工艺不合理，复合物形成过多
（4）感染杂菌
（5）泡敌选择不理想
7.发酵过程中，产酸后，GA又下降
（1）pH过高，谷氨酰胺合成酶活性下降
（2）感染杂菌
8.谷氨酸浓度急剧增加原因：
感染phage
V
柠檬酸（DCA循环封闭）
谷氨酸
体系不存在CO2固定反应：
3/2C6H12O6+NH4+==C5H9O4+4CO2产率：
147/（180*3/2）==54.4%
体
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