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1、3.菌种扩大培养的目的和意义是什么？（1）提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。目的是：a、缩短发酵周期，降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的） b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。（2） 让菌种从固体试管、液体试管、三角瓶、种子罐、发酵罐逐级扩大，逐步适应大环境 的生产。（3） 菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象。通过连续的扩大培养，每一级都要进行严格的检查，对于不合格的严禁使用，增加了生产 的可靠性。4.工业生产用菌种的基本要求有什么？（1 ）具有稳定的遗传学特性（2 ）微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求（3）生长条件易

2、于满足（“临界溶氧浓度” pH值等）（4 ）对于细菌，希望具有抗噬菌体的能力。（5 ）具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率和反应速度，进而 可以缩短发酵周期，降低生产成本。（6）对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细 胞不易发生菌体自溶。对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎； 对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内， 对于包含体，要求在细胞破碎时不易破碎， 而在目的产物的分离提出时，则易破碎 。5.微生物发酵常用的菌种有哪些？1.细菌类：短杆菌：GA,GIn,lys 枯草芽抱杆菌：淀粉酶（BF7658、碱性蛋白酶等J 地衣芽抱杆菌：H

3、ASS耐高温a -淀粉酶）a -Amylase 苏云金芽抱杆菌：BT生物农药.梭状芽抱杆菌：丙酮、丁酸等的发酵2.酵母菌啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵I酒精酵母：汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵I假丝酵母：scp生产，石油发酵3.霉菌.黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、酶制剂工业（糖化酶）黄曲霉：酱油生产（3042），面酱J 青霉菌：青霉素的生产十 红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；使用红色色 素的生产；豆腐乳的生产等赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生长激素4.放线菌：各种抗生素，链、土、庆大等第三章1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？（1、

4、淀粉及其水解糖液（2、含有淀粉及其水解产物的废弃物：味精废水、粉丝生产废水等（3、化工石油产品：醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等4）纤维素2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？1无机氮源：氨水、尿素（有脲酶微生物）、（NH4）2S04 NH4NO3 NH4CL等2有机氮源 : 豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、菌体蛋白、玉米蛋白粉等3.淀粉的水解方法主要有什么？试进行优缺点比较？酸法水解的主要副产物是 什么？淀粉的水解 方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法。 酸法： （优）生产方法简单易行；对设备要求简单；水解时间短；生产能力大。（缺）反应条件比较强烈；产生的副产物较多。双酶

5、法：（ 1）酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的生长有利。双酶法淀粉水解首先使用耐高温 a-淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖 很少，不具备生成副产物的物质条件。（2） 淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可以提高 10%以上。（3） 可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条件温和，对于粮食中的蛋白 质等其他物质的破坏较少。（4） 双酶法水解使用的淀粉乳浓度较高， 可以达到20Be以上，而采用酸法水解，淀粉乳的 浓度通常只有 12Be。酸法水解的主要副产物 ：（ 1）双分子葡萄糖脱水，形成复合二糖，分别是异麦芽糖、龙胆二糖。 前者不利于产物的结晶提出；后者对于菌体的生

6、长有抑制作用。（2） 一分子葡萄糖脱水，形成 5-羟甲基糠醛，对于菌体的生长有抑制作用。（3） 一分子葡萄糖和 -NH2 反应，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。4.双酶法淀粉的水解通常使用哪 2 种酶？其作用特点分别是什么？a -淀粉酶 ： 又称为淀粉液化酶， 只作用于淀粉 a -1 ， 4葡萄糖苷键， 其作用特点是可以快速 将长链的淀粉水解成短链糊精， 其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢， 换言之， 该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖， 因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主， 含有 少量的葡萄糖。淀粉 a -1， 4；1， 6葡萄糖苷酶 ： 又称糖化酶，可以水解淀粉分

7、子的 a -1， 4或 a -1， 6葡 萄糖苷键，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。5.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？ 灭菌过 程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。灭菌就是杀死一切微生物， 包括微生物的营养体和芽孢， 在工业生产中， 对于培养基、 管道、 设备的灭菌， 通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为 湿热灭菌。 借助蒸汽释放的热能使微生物细胞内蛋白质、 酶、核酸分子内部的化学键特别是 氢键受到破坏， 引起不可逆的变性， 致使微生物死亡。 在有水分存在的情况下蛋白质更易受 热而凝固变性。 湿热

8、灭菌的显著优点是： 使用方便，无污染， 而且其冷凝水可以直接冷凝在 培养基 中，也可以通过管道排出。理论灭菌时间 ： t = 2.303/k * lnN 0/NS实际生产中 ：间歇灭菌：121 C 20-30min连续灭菌：137 C 15-30S 在维持罐中保温 8-20min6.生物反应器灭菌的操作要点有什么？将配置好培养基打入生物反应器内进行实消，操作要点如下：（1）定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。（2）培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气，当培养基的温度升到灭菌温度时，进入保温操作阶段， 此时要求与反应器相连的所有管道处于两个状态： 进汽或出汽，目的是对管道进

9、行灭菌。（3） 培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到 100 C时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基的温度升温到 100C时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。（4）注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。（5） 保温期间，要求罐压： 0.09 0.10MPa,温度：118121 C，时间：30分钟。（6）灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基 的冷却使罐内形成负压，易染菌。（7） 配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌时的稀释（体积的增加） ，通常体积可增加 20%左右，灭菌时间越

10、长，体积增加的越多。7以化学反应动力学为基础，说明高温短时灭菌可以减少培养基营养成分损失 的原因。培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应，对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加， 但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：Ig（k2/k1）/lg（k,2/ k,1）= E / E, （5）实验证明：营养成分为破坏的反应的活化能 E的值为E, = 8.36 83.6*103 J/mol而菌体死亡的活化能 E厂 芽孢：E = 418*103 J/molE = Y* 无芽孢：E = 209 250*103 J/mol显然，（5）式的比值1,说明提

11、高温度对于第二个平行反应， 即菌体死亡的反应是有利的。提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是， 达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常数增加的少， 因此,有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。 换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。8掌握以下几个概念：理论灭菌时间：理论计算中培养基的灭菌过程所用的时间 t = 2.303/k * lnN o/Ns式中 N0, NS:分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个 /ml ）-k : 表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数对数残留定律：即微生物的热致死规律，在一定温度下，微

12、生物热死遵循分子反应速度理 论，在微生物受热失活的过程中，微生物不断被杀死，活菌数不断减少，其减少速度随活菌 残量的减少而降低。一 dN/dt=K*N实消：将配置好的培养基放在发酵罐或其他容器中， 通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌 的操作过程。 优点：不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。空消： 在生物反应器内没有物质时对其进行灭菌。 意义：由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的 传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都 要进行空消。采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消。连消 : 将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷

13、却而进行灭 菌。 优点: 营养成分破坏少，生产效率高；热综合利用率高；大型企业自动化程度高。第四章1. 基本概念：能荷： 生物体所具有的能量水平 。能荷 = （ATP +1/2ADP ）/ （ ATP +ADP +AMP） 显然，能荷在 0 1 之间。甘油发酵： 在厌氧或好氧条件下培养酵母，利用糖分解生成甘油的过程。侧系呼吸链：NAD（P）H经过该呼吸链，可正常传递 H+,将其氧化为H2Q但是并没有氧化磷 酸化生成ATP,不能够正常产生 ATP的呼吸链称之为侧系呼吸链。标准呼吸链：NAD（P）H经过该呼吸链，可正常传递 H+,将其氧化为H2Q并能正常氧化磷酸 化生成ATP的呼吸链称之为标准呼吸

14、链。二氧化碳固定化反应： 二氧化碳在酶的作用下转化为还原性有机化合物的过程 初级代谢： 是指微生物合成它们生长所必需的物质的诸如： 糖、氨基酸等以及由这些化合物 形成的高分子物质如：多糖、蛋白质、核酸等的代谢，称之为初级代谢。那么，这些化合物 统称之为：初级代谢产物。次级代谢： 是指微生物在生长后期进行的与他们的生长无明显关系的代谢， 这一类的物质统称之为：次级代谢产物。例如：抗生素、激素、某些酶制剂等。分叉中间体： 处于代谢的分叉点上， 既可以合成初级代谢产物， 又可用来合成次级代谢产物， 把微生物的初级代谢和次级代谢紧密联系起来的物质。发酵逆转： 发酵中期当微生物群体进入产物合成期时， 如

15、果向发酵液中流加氮源或碳源或改 变发酵条件，使微生物群体返回到生长期而停止产物的合成，这种现象称之为发酵逆转。反馈抑制： 是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该 途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。协同反馈抑制： 就是该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合， 但是并不影响该酶的活性， 只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后， 其活性才受到 抑制。营养缺陷型： 某些菌株发生突变后， 失去合成某些对该菌株生长必不可少的物质的能力， 必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。抗性突变株： 是指野生型菌株因发生基因突变，

16、而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗 性变异类型。分解代谢阻遏： 当培养基中同时存在多种可供利用的底物时， 分解利用某些底物的酶往往被 最容易利用的底物所阻遏。又称之为葡萄糖效应。代谢控制发酵： 是指利用生物的、 物理的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代谢途 径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。DCA循环：在异柠檬酸裂解酶的催化下， 异柠檬酸被直接分解为乙醛酸，乙醛酸又在乙酰辅酶A参与下，由苹果酸合成酶催化生成苹果酸，苹果酸再氧化脱氢生成草酰乙酸的过程。2.厌氧甘油发酵和好氧甘油发酵的优缺点比较。甘油厌氧发酵的缺点：a.菌体死亡率较高，碱性条件；无能量产生；b.转化率较低，

17、实际转化率远低于 50%c.由于残糖的存在，导致甘油的提出率更低。 （我们国家没有超过 70%）好氧发酵：优点：在适当（或者说有限的好氧）好氧的条件下，酵母细胞进行有限的好氧呼吸，糖酵 解产生的丙酮酸可以通过 TCA循环来增加其产能水平， 一方面减少3磷酸甘油醛向乙醛方向进行，增加底物向产物转化的比例；另一方面， 增加了细胞能量水平，减少了细胞的死亡率，有利于提高发酵的速率，缩短发酵周期。缺点:这种有限的好氧发酵，使得丙酮酸进行 TCA循环的同时，也增加了 TCA循环过程中的许多中间性产物的产生，这对于甘油的提取带来了不利的影响。3.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？C 6H12Q（

18、1） 点：EMP畅通无阻控制MHnH浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制控制溶氧，防止侧系呼吸链失活丙酮酸+丙酮酸（2） 点：通过CO固定反应生成G二羧酸，强化这一反应的方和 法：添加辅酶生物素乙酰辅酶A + C4二羧酸（3）点：柠檬酸后述的酶的酶活性丧失或很低， 控制培养基 卄 中的Fe2+的浓度柠檬酸4.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。在柠檬酸产生菌体内存在一条侧系呼吸链， 该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如 果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间， 或者 在这期间中断供氧一段时间（20分钟，根据处理情况如：紧急保压等）。则这一 侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产

19、酸，而是产生了大量的菌体，因 为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的 ATP用于菌体自身 的生长上，这种现象在生产上通常称之为：只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗 了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败。5.简述二氧化碳固定反映对于提高柠檬酸产率的意义。葡萄糖经过EMP途径生成丙酮酸后，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成了乙酰 辅酶A（CH3CO-CoA）则合成一分子柠檬酸需要3分子的CH3CO-CQA也就是需要 1.5分子的葡萄糖；如果其中一分子的丙酮酸通过 CO2固定反应生成一分子的C4 二羧酸，那么合成一分子的柠檬酸需要 1分子的葡萄糖，产率可以大大的提高。6.比较细菌发酵和酵母发

20、酵的优缺点（1）细菌菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产率高。（2） 细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有几分钟，而酵母的增殖速 度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。（3） 细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来 促进产物的分泌，例如， GA的发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。（4 ）对于细菌的诱变与选育手段多，改变细菌的遗传特性很容易，对酵母菌的诱变需剥离 开细胞壁与细胞膜。（1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出， 或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌

21、难以分离。（2） 细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求 也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。（3） 细菌发酵易感染噬菌体。7.写出大肠杆菌中Lys代谢途径，说明利用大肠杆菌发酵生产 Lys的菌种特性和控制要点。GlucoseEMP丙酮酸草酰乙酸Asp *（天冬氨酸激酶AK同功酶）Lys天冬氨酸B -半醛羟吡啶羧酸（同功酶）天冬氨酸磷酸（asp-p ）Met Thr大肠杆菌赖氨酸代谢特点： 天冬氨酸激酶是一个关键酶，分别受三个代谢产物的抑制，这三个终产物分别是：Lys、Met和Thr，只有当这三个代谢产物同时过量时， Asp激酶的活性才能完全被抑制。控制要

22、点：要使菌体合成并积累 Lys，可以选育Hos，这样的话，既可以解除 天冬氨酸的代谢支路，使代谢流向Lys的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率； 更重要的是由于Hos，使得代谢过程中不可能产生过量的 Met、Thr，尽管产生了大量的 Lys， Lys可以抑制关键酶一一天冬氨酸激酶 1但是天冬氨酸激酶 2、3的活性由于 Met、Thr的限量， 并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸 半醛，仍可以大量的生成，这就保证了 Lys的生物合成途径的畅通无阻。8.Lys的菌种写出黄色短杆菌中Lys代谢途径，说明利用黄色短杆菌发酵生产 特性和控制要点。EMP j天冬氨酸磷酸（asp-p）高丝氨酸a珀酰高

23、丝氨酸O礪酸高丝氨酸MetThr特点：（1）天冬氨酸激酶（AK）,在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别 受Lys、Thr的协同反馈抑制。（2）黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制， 如图所示（ ）,即优先合成Hos,然后再优先合成 Met，当Met过量时，阻遏：催化 Hos 琥珀酰高丝氨酸所需要的酶的合成（即，琥珀酰高丝氨酸合成酶），使代谢流向合成 Thr的方向进行，当Thr过量时，反馈 抑制：Asp- 3 -半醛 Hos 所需要的酶的的活性（即高丝氨酸脱氢酶） ，使代谢流向Lys的合成上。根据以上代谢特点，利用黄色短杆菌生产 Lys，需要选用Hos-,尽管，从理论上讲，选

24、育Hos-进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给 Thr,则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上 Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用。因此，对于黄色短杆菌 的 Lys 发酵，仅仅选育 Hos- 是不够的但是为了高效率的转化 Lys ，可以选育结构类似物抗 性突变株：（1）S-L-半胱氨酸抗性突变株 AECr （2） 丫 -甲基赖氨酸抗性突变株 MLr （3） L-赖氨酸氧 肟酸盐抗性突变株 LysHxr （ 4）苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株 ThrHxr使用黄色短杆菌进行赖氨酸的发酵，还可以选育具有双重标记的营养缺陷型突变株 （ Met- + Thr- ） , 其本质上和 Hos-

25、是一样的，但双重标记的营养缺陷型突变株的优点是： 遗传性质稳定，恢复突变的几率少。9.谷氨酸发酵生产过程中，主要出现哪些异常现象？其危害是什么？产生的原 因是什么？如何处理？1.发酵前期 pH 值过高 危害：影响菌体正常生长；发酵周期延长；成本增加；易发生菌体自溶。影响因素：（ 1）耗糖速度过慢（就是糖的代谢速度过慢）（ 2）初脲量大，菌种脲酶活力高导致铵离子浓度高（ 3）感染 phage（4）培 养基 中缺乏磷酸盐等处理方法：（ 1）耗氧速度慢，通过测定糖的含量确定，可以强化通风，适当添加生物素等（ 2）初脲量大，停止通风，或者小通风，以使尿素缓慢释放铵离子（ 4）缺乏磷酸盐2.初期pH值偏

26、低危害： 影响因素及处理方法：（ 1 ）初脲添加量不够，提前酌情流加尿素（ 2）泡尿（ 3）培养基中的磷酸盐过高，代谢平衡被打破，酸性产物的积累（ 4）供氧不足 通风量 搅拌转速 发酵罐压力结构参数（挡板 空气分布器 搅拌桨形式）3.接种后菌体生长不良， ODf直偏低，耗糖速度减慢发酵周期长；菌体活力低；核酸转化率偏低原因：（ 1 ）可能感染 phage（ 2）培养基存在问题：缺乏磷酸盐、缺乏生物素、存在抑制菌体生长的物质培养基灭菌产生的抑制性物质（3）通风量过大，溶氧水平高。使得菌体耗糖速度降低（4 ）种子不良，种子衰老，接种温度过高导致菌体被烫死（5 ）前期通风较少，pH值偏低，代谢产物积

27、累较多的酸性物质，不利于菌体的生长4中后期，ODf直继续升高，耗糖快，但是产酸很低只长菌不产酸（1）生物素浓度过高（2）感染杂菌，可通过镜检初步判断是否感染杂菌5.发酵中后期pH值偏低，耗糖快，但是产酸低或不产酸（1）感染杂菌（2）供氧不足，导致酸性产物的积累（3） 生物素浓度过高，磷酸盐浓度过高，导致 OD直增长太快大量的通风、提前流加尿素6.发酵过程中发酵液泡沫太多（1）淀粉质量差，杂质多，蛋白质含量高（2）糖化不完全，糖化液中含有糊精（3）糖化工艺不合理，复合物形成过多（4）感染杂菌（5）泡敌选择不理想7.发酵过程中，产酸后， GA又下降（1） pH过高，谷氨酰胺合成酶活性下降（2）感染杂菌8.谷氨酸浓度急剧增加 原因：感染phageV柠檬酸（DCA循环封闭）谷氨酸体系不存在CO2固定反应：3/2 C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4 + 4 CO2 产率：147 / （ 180*3/2） = 54.4%体