微生物检验技术及其应用医疗器械.ppt

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微生物检验技术及其应用微生物检验技术及其应用微生物检验技术及其应用微生物检验技术及其应用上海市食品药品检验所上海市食品药品检验所抗生素室、食品二室抗生素室、食品二室徐伟东徐伟东博士博士2011年年11月月29日日简简介介微生物鉴定分型技术在检验中的应用微生物鉴定分型技术在检验中的应用微生物检验技术介绍微生物检验技术介绍一一二二微生物主要来源微生物主要来源u土壤：

微生物的百花园土壤：

微生物的百花园u水：

污染源水：

污染源途径途径u空气：

干燥空气：

干燥过路客过路客u人和动物人和动物u加工环节加工环节一、微生物检验技术介绍一、微生物检验技术介绍食品安全的主要因素食品安全的主要因素关注欧洲关注欧洲104：

4型肠出血性大肠杆菌疫情型肠出血性大肠杆菌疫情u西班牙阿尔梅里亚省和马拉加省的两西班牙阿尔梅里亚省和马拉加省的两家出口商受其感染后，患者会出现腹家出口商受其感染后，患者会出现腹部绞痛和腹泻，尿毒症死亡部绞痛和腹泻，尿毒症死亡u德国疾病控制机构疫情的源头精确至德国疾病控制机构疫情的源头精确至芽苗类蔬菜中的豆芽。

由于发豆芽作芽苗类蔬菜中的豆芽。

由于发豆芽作坊卫生条件不佳，豆芽受污染，加上坊卫生条件不佳，豆芽受污染，加上一些人喜好在蔬菜沙拉中拌入生豆芽，一些人喜好在蔬菜沙拉中拌入生豆芽，致使病菌直接进入人体消化道。

食品致使病菌直接进入人体消化道。

食品安全和微生物专家同一天说，其实，安全和微生物专家同一天说，其实，错不在豆芽，而在人们不健康的饮食错不在豆芽，而在人们不健康的饮食习惯。

尽管一些蔬菜外表光鲜，实际习惯。

尽管一些蔬菜外表光鲜，实际却暗藏杀机。

对多数蔬菜而言，煮食却暗藏杀机。

对多数蔬菜而言，煮食才健康。

才健康。

u公报说，德国公报说，德国104：

4型大肠杆菌疫情型大肠杆菌疫情暴发目前已可得到解释，其原因很可能是从暴发目前已可得到解释，其原因很可能是从埃及埃及进口的进口的胡芦巴种子胡芦巴种子被大肠杆菌污染，消被大肠杆菌污染，消费者食用德国企业用这些种子培育的芽苗菜费者食用德国企业用这些种子培育的芽苗菜后导致感染。

此外还有人际接触造成的感染后导致感染。

此外还有人际接触造成的感染病例。

病例。

德国健康部门称，目前还不能排除其他德国健康部门称，目前还不能排除其他种子由于产地不卫生的生产环境而被污染的种子由于产地不卫生的生产环境而被污染的可能性。

同时中间商在清洗、混合和包装不可能性。

同时中间商在清洗、混合和包装不同种子时也可能造成病菌污染其他种子。

因同种子时也可能造成病菌污染其他种子。

因此，健康部门要求消费者不要生食各种市场此，健康部门要求消费者不要生食各种市场上供应的或自培的芽苗菜。

消费者还被告诫上供应的或自培的芽苗菜。

消费者还被告诫应将尚存的芽苗菜种子清入垃圾箱。

应将尚存的芽苗菜种子清入垃圾箱。

目前，分管食品安全的联邦风险评估研目前，分管食品安全的联邦风险评估研究所还在评估芽苗菜之外其他由胡芦巴种子究所还在评估芽苗菜之外其他由胡芦巴种子加工的产品中是否带菌，原因是胡芦巴种子加工的产品中是否带菌，原因是胡芦巴种子还经常被用作佐料或入药。

还经常被用作佐料或入药。

u新华网开罗新华网开罗7月月6日电（记者李来房冯康）埃及农业检疫部门日电（记者李来房冯康）埃及农业检疫部门6日发表声明，否认埃日发表声明，否认埃及出口的葫芦巴种子是欧洲肠出血性大肠杆菌疫情的源头。

及出口的葫芦巴种子是欧洲肠出血性大肠杆菌疫情的源头。

埃及农业部网站当天刊登声明说，埃及当局对相关出口商库存的葫芦巴种子进行埃及农业部网站当天刊登声明说，埃及当局对相关出口商库存的葫芦巴种子进行了抽样检测，所有结果均为肠出血性大肠杆菌阴性。

了抽样检测，所有结果均为肠出血性大肠杆菌阴性。

声明称，埃及声明称，埃及2009年出口到欧洲的葫芦巴种子都通过了各国卫生检疫机构的检年出口到欧洲的葫芦巴种子都通过了各国卫生检疫机构的检查，当时并未检测出这一污染，而且查，当时并未检测出这一污染，而且2009年年11月出口的葫芦巴种子是干种子，这月出口的葫芦巴种子是干种子，这种细菌在干燥表面上不可能存活到今年种细菌在干燥表面上不可能存活到今年6月。

月。

声明认为，若怀疑葫芦巴种子遭到肠出血性大肠杆菌污染，这可能与再包装或用声明认为，若怀疑葫芦巴种子遭到肠出血性大肠杆菌污染，这可能与再包装或用来泡芽的水等处理环节有关。

来泡芽的水等处理环节有关。

声明称，埃及国内没有肠出血性大肠杆菌病例的报告，埃及的种子是安全的，向声明称，埃及国内没有肠出血性大肠杆菌病例的报告，埃及的种子是安全的，向欧洲出口蔬菜种子的绝大多数埃及出口商都非常重视整个供应链的卫生要求。

欧洲出口蔬菜种子的绝大多数埃及出口商都非常重视整个供应链的卫生要求。

欧洲食品安全署欧洲食品安全署5日发布报告称，在德国和法国暴发的肠出血性大肠杆菌疫情的日发布报告称，在德国和法国暴发的肠出血性大肠杆菌疫情的源头很有可能是从埃及进口的葫芦巴种子。

欧盟委员会负责卫生与消费者事务的委员源头很有可能是从埃及进口的葫芦巴种子。

欧盟委员会负责卫生与消费者事务的委员约翰约翰达利表示：

达利表示：

“报告发布后我们便着手从市场上回收从埃及进口的种子并暂时禁报告发布后我们便着手从市场上回收从埃及进口的种子并暂时禁止从埃及进口相关品种。

止从埃及进口相关品种。

”根据德国主管传染病防控的罗伯特根据德国主管传染病防控的罗伯特科赫研究所科赫研究所5日公布的疫情通报，德国自两个日公布的疫情通报，德国自两个月前暴发肠出血性大肠杆菌疫情至今，已累计出现月前暴发肠出血性大肠杆菌疫情至今，已累计出现4086例感染病例，共有例感染病例，共有48人死人死亡。

本月亡。

本月2日法国也宣布出现首例感染肠出血性大肠杆菌死亡病例。

日法国也宣布出现首例感染肠出血性大肠杆菌死亡病例。

一、微生物检验技术介绍一、微生物检验技术介绍检测技术的重要性检测技术的重要性革兰氏染色镜鉴革兰氏染色镜鉴按照标准进行按照标准进行传统的生化反应鉴定传统的生化反应鉴定API试剂条试剂条菌鉴定国际金标准菌鉴定国际金标准半自动细菌鉴定仪半自动细菌鉴定仪（ATBExpression）全自动细菌鉴定仪全自动细菌鉴定仪（VITEK2）微生物鉴定微生物鉴定MiniVIDAS筛选系统筛选系统免疫凝集免疫凝集/免疫沉淀实验免疫沉淀实验微生物检测微生物检测实时荧光定量实时荧光定量PCR色谱、光谱分析技术色谱、光谱分析技术分子生物分子生物学技术学技术一、微生物检验技术介绍一、微生物检验技术介绍传统筛选系统传统筛选系统一、微生物技术介绍一、微生物技术介绍微生物的鉴定及其分型技术微生物的鉴定及其分型技术1.2微生物的检测技术微生物的检测技术1.1微生物的检测技术微生物的检测技术c）c）酶联免疫荧光技术酶联免疫荧光技术d）d）实时荧光定量实时荧光定量PCRe）e）免疫磁珠技术免疫磁珠技术b）b）乳胶凝集反应乳胶凝集反应a）a）常规培养鉴定法常规培养鉴定法显色培养显色培养基法基法显色培养基显色培养基u显色培养基检测基本原理：

利用不同种属细菌显色培养基检测基本原理：

利用不同种属细菌代谢所产生的酶的特异性，在培养基中加入相代谢所产生的酶的特异性，在培养基中加入相应的特异性酶底物和抑制剂，当具有某特异酶应的特异性酶底物和抑制剂，当具有某特异酶的细菌与酶底物作用时，使显色基团游离出来的细菌与酶底物作用时，使显色基团游离出来附着于菌落上，形成颜色独特的菌落。

根据菌附着于菌落上，形成颜色独特的菌落。

根据菌落的颜色直接对菌属（种）作出鉴定。

落的颜色直接对菌属（种）作出鉴定。

GB4789-2008、2010中中新技术的应用新技术的应用-显色培养基显色培养基u沙门氏菌沙门氏菌u志贺菌志贺菌u副溶血性弧菌副溶血性弧菌uO157：

H7大肠埃希菌大肠埃希菌u单增李斯特菌单增李斯特菌u阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌u大肠杆菌计数大肠杆菌计数显色培养基的优势显色培养基的优势u快速、简便、节省时间快速、简便、节省时间-大多数显色培养基只需在样品增大多数显色培养基只需在样品增菌后，分离培养菌后，分离培养1824h，即可根据菌落的颜色作出初，即可根据菌落的颜色作出初步的鉴定。

（阴性步的鉴定。

（阴性-弃去；阳性弃去；阳性-进一步鉴定）。

进一步鉴定）。

u结果直观，一目了然（根据颜色判定结果）。

结果直观，一目了然（根据颜色判定结果）。

u灵敏度高、特异性强，大大减少了后续的鉴定步骤（确灵敏度高、特异性强，大大减少了后续的鉴定步骤（确证试验）。

证试验）。

显色培养的缺陷显色培养的缺陷u假阳性：

假阳性：

97%的大肠埃希菌含有的大肠埃希菌含有-葡萄糖苷酶，约葡萄糖苷酶，约10%的沙门的沙门氏菌属中也含有此酶。

氏菌属中也含有此酶。

u假阴性：

假阴性：

O157：

H7大肠埃希菌没有大肠埃希菌没有-葡萄糖苷酶，在葡萄糖苷酶，在MUG-LST上呈阴性反应。

上呈阴性反应。

不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培养基中呈不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培养基中呈阳性反应。

阳性反应。

u提示：

这是任何选择性培养基都无法避免的问题。

与普通提示：

这是任何选择性培养基都无法避免的问题。

与普通选择性培养基比较，显色培养基的假阳性、假阴性的机率选择性培养基比较，显色培养基的假阳性、假阴性的机率相对要低得多。

相对要低得多。

乳胶凝集反应乳胶凝集反应u原理：

原理：

u乳胶凝剂试验是以乳胶微粒为载体的间接凝集乳胶凝剂试验是以乳胶微粒为载体的间接凝集试验。

试验。

u用人工方法将抗体包被于与免疫无关的大分子用人工方法将抗体包被于与免疫无关的大分子聚苯乙烯或羧化聚苯乙烯乳胶颗粒上。

聚苯乙烯或羧化聚苯乙烯乳胶颗粒上。

u利用抗原抗体特异性结合的特性，当敏感的乳利用抗原抗体特异性结合的特性，当敏感的乳胶颗粒与待检细菌菌悬液混合后，迅速形成肉胶颗粒与待检细菌菌悬液混合后，迅速形成肉眼可见的凝集团块，用于筛选可疑菌。

眼可见的凝集团块，用于筛选可疑菌。

乳胶凝集试验的优势乳胶凝集试验的优势u特异、敏感；特异、敏感；u操作简便、快速；操作简便、快速；u结果易判读；结果易判读；u阴性预测值高。

阴性预测值高。

常用常用Microgen乳胶凝集试验盒乳胶凝集试验盒u李斯特菌（李斯特菌（listeria）u沙门氏菌（沙门氏菌（salmonella）u弯曲杆菌（弯曲杆菌（camylobacter）u大肠杆菌大肠杆菌O157（E.coliO157）u军团菌（军团菌（legionella）u葡萄球菌（葡萄球菌（staph）观察凝集结果观察凝集结果全自动荧光免疫分析仪全自动荧光免疫分析仪（VIDAS-mini或或30）检测项目：

目：

食品及环境中常见致病性细菌（李斯特菌属、单核增生李斯特菌、弯曲菌属、大肠埃希菌O157、沙门氏菌属、葡萄球菌肠毒素检测）的快速筛检全自动荧光免疫分析仪全自动荧光免疫分析仪（VIDAS）u原理：

原理：

以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，最以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，最后测蓝色荧光（后测蓝色荧光（ELFA）。

包被针上有抗体包被，所测得的）。

包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。

荧光与标本中抗原的含量成正比。

u特点：

特点：

结果准确：

对每个标本做两次免疫反应，保证结果的可靠。

结果准确：

对每个标本做两次免疫反应，保证结果的可靠。

灵敏度比可见光方法高出灵敏度比可见光方法高出1000倍。

已获得美国倍。

已获得美国FDA、日本、日本厚生省、厚生省、AOAC、USDA、中国进出口商品检验局等政府及、中国进出口商品检验局等政府及权威机构认可。

权威机构认可。

可同时进行可同时进行12个相同或不同的测试。

每天进行约个相同或不同的测试。

每天进行约6080项项测试测试特异性强：

标本不需分离出目标微生物即可上机检测。

特异性强：

标本不需分离出目标微生物即可上机检测。

避免交叉污染：

没有采样针，避免标本之间交叉污染；样品避免交叉污染：

没有采样针，避免标本之间交叉污染；样品不与仪器接触，仪器内没有抽吸样品的管路，杜绝了标本对不与仪器接触，仪器内没有抽吸样品的管路，杜绝了标本对环境的污染环境的污染荧光定量荧光定量PCR聚合酶链式反应技术（聚合酶链式反应技术（PCR）是分