生物工程生物技术专业英语翻译Word文件下载.docx
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这个只能通过在生产过程中对有机体的生长进行最大的控制得以实现。
从一个野生型发展到工业有机体需要改变它的遗传信息，消除不要的特点或者甚至是引入整个新的遗传信息。
寻找所要的有机体并且提高它的性能（capabilities）是目前大部分生物工程过程的最基本的方面（图3.1菌株改造流程图）
3.1选择与筛选
在生物技术的所有方面中，最主要的精力都用在了筛选程序（progaramme）上,以通过突变或者杂交程序（progaramme）包括遗传设计的途径，从天然资源或者已经建立的培养物中生产出新的有机体。
这些有机体必须经过筛选来获得有用的产品并且可以进行足够大规模的生长以生产和提取所期望的产品，然后对这个产品进行鉴定评估（evaluation）。
筛选可以定义为利用高效选择程序从庞大的微生物与代谢物中只检测和分离那些有益的微生物与代谢产物。
对分离物进一步的改进包括对培养物的改造与保存。
然而，对充分利用这个能力来说最大的障碍是适宜的筛选程序的可行性，这个筛选程序能鉴别所必需的产物，尤其在存在培养基组分的情况下。
现在生物工程中利用的主要的生物群体是微生物。
所述的筛选方法也主要集中于这类群体。
在从环境中为生物工程寻找新的微生物的过程中，一般有三种可行性的选择；
它们包括取样点的选择，分离出想要的微生物的物理分离过程以及实现选择的方法的选用，这个过程大多数情况下要进行富集培养（表3.1生产微生物的创造）。
尽管许多新的生产微生物是野生型而且已经从自然环境中分离出来，但是通过实验操作从现存的基因组制造新的基因组同样花费了大部分的精力。
通过突变、重组、转化、转导和基因克隆的单一处理过程或者联合处理过程可以对有机体进行改造（表3.1生产微生物的创造）。
。
通过自然选择，尤其更多的是基因操作，所有工业重要的微生物都将经过某些形式的筛选。
筛选程序的设计对实现最大程度的认知新基因性来说是很重要的。
筛选可分为两个基本形式：
（1）无选择的随机筛选对所有分离物进行单独检测，以获得所要的性质
（2）比率筛选在这个过程中，会进行某些方面的预筛选。
随机筛选将是非常耗时的，因为每个分离物都要进行仔细的研究。
在抗生素生产的研究中，成千上万的摇瓶培养的单一孢子分离物进行有规律的使用。
Agardisc琼脂板技术加快了这个过程，但这个方法最好是用作在使用摇瓶之前作为一种最初的筛选。
大量的分离物或者突变体现在就可以平铺开来，暴露于广泛的环境条件下，同时任意时间段的反应就可以通过电视监控或者计算机控制而被自动记录下来。
相反的，比率筛选更多的是利用了特定产物形成的生物化学知识，建立一个选择过程，这个过程利用了所要的基因型的一个特点，这个特点不是特定的有益的那一个，但必须是很容易进行评价scored或者assayed化验。
比率筛选应该有选择的杀死所有不需要的基因型从而允许routinely检测更多的分离物。
因此，最近已表明inCephalosporiumacremonium抗生素的生产与蛋白水解活性proteolyticactivity相关,这说明了进行筛选一个可能的基础。
当筛选过程完成以及有潜在价值的微生物分离后，效率的最终证明来自生产条件。
从新的或者现存的微生物进行产品的优化也涉及到最佳培养条件的选择，固体或者液体、分批或者连续发酵。
繁殖微生物的培养基类型对于形成产物的表型表达有着重要的影响。
因此，培养基的组成能够影响生物体的浓度、形成产物的特定速率specificrate、产物形成的持续时间、产物的降解速率及生产微生物（生产菌）的稳定性。
然而，生产环境是不稳定的，成功的生产也需要对培养基和环境控制参数进行改造。
菌种的退化是生物工程中普遍遇到的一个问题。
稳定性是由基因控制的，可以通过环境因素的特定控制进行改变，比如改变培养基或者通过阻止导致不稳定的遗传事件的发生。
3.2菌种保藏
通过自然选择或者基因操作产生一个新的微生物，这个新的有机体就必须进行储藏或者保藏以使遗传性能发生最小的退化。
有机体的保藏、制备和繁殖必须达到一定标准的重复性。
一个工业微生物的保藏过程生物工程基础结构的整体特征。
所有的工业没有一个共同的方法。
特定的工业微生物保藏技术作为商业机密而被很好的保守。
实际上，大部分工业微生物通过下列的程序被保存的：
（1）在琼脂培养基上进行规律性接种；
（2）利用还原性代谢产物——矿物油的覆盖、冷藏或者冷冻储存；
（3）干燥——干燥的沙子、硅胶或者滤纸；
（4）冷冻干燥——由于与前面方法相比更加方便而且稳定性高所以被广泛采用；
（5）在超低温下冰冻保存（-70―-196℃——是一个高成本的方法但是适用范围广而且存活率高）。
在全世界范围内，菌种收集对于生物工程大范围的纯种微生物的供应正扮演着越来越重要的角色，这些微生物有着过去、现在或者潜在的价值。
重要的操作菌株必须处于可进行繁殖与生产的条件下。
尤其是，很多新的基因操作有机体都有不同程度的不稳定性而且保藏必须以获得最小的菌种漂移为目标。
这章余下的内容将较具体的讲述目前应用遗传学家可用的对工业重要有机体进行改造的各种各样的技术。
3.3诱变作用
一旦一个有用的有机体经过最初的筛选被分离出来，那么对提高生产力的一些选择条件就可以使用了，包括对培养基和发酵条件的改变，诱变（自然发生或者是诱导发生）和杂交。
既然诱变是所有遗传变化的根本来源，那么它就成为了在工业微生物学中有着根本重要性的一个话题。
而且，这些工业中使用的很多重要的微生物没有正常的性特征，因此不易进行杂交。
基于这个原因，各种各样的诱变技术就被大量采用以生产许多目前在使用的生产菌株。
对于很多工业化过程，诱变程序确实代表着提高生产力所主要采用的方法。
诱变剂—诱导提高生产力或者滴度的方法长期以来都在使用，青霉素、Cephalosporuim和Streptomyces的抗生素生产，有机酸生产与用Aspergillusspecies生产酶，用各种菌种生产氨基酸以及其他大量的工业微生物。
诱变作用还无法被更新的基因工程技术所代替。
现在已经认识到，提高一个发酵产物产量最有效的方法是利用诱导突变和其后对改变菌株的筛选。
最困难的是突变发生的频率低而且还必须从庞大的没有突变的菌株中进行选择。
有许多关于经重要突变所生产的改造工业菌株生产出更有效验的产品的例子。
四环素的生产菌株Streptomyces在这方面尤为重要。
发现S.aureofaciens的突变株S-604可以合成6-demethyltetracycline脱甲基四环素，而不是由亲代生产菌株合成的。
这个突变现在是一个重要的商业化程序。
尽管如此，很少的突变能够成为改造菌株的主要方法。
这种突变通常对形成产物带来小的改变（5%-10%）而没有任何表型表现。
连续的利用小的突变可能导致负责原始基因型生产力的遗传因素的增加。
生产头孢菌素的有机体与生产青霉素的Penicilliiumchrysogenum菌株一样有着特殊的价值。
诱变剂的选择尽管诱变剂分为物理和化学来源，但是对于工业遗传学家来说这没有多大的联系。
选择的主要理由是所选择的技术能够生产尽可能大范围的突变异种以供选择。
许多诱导的突变作用不是DNA损伤类型的直接结果而是细胞DNA修复过程作用于损伤处使其在碱基序列上发生了固定的改动的结果。
能够导致这种现象发生的诱变剂包括紫外线、离子射线、胸腺嘧啶饥饿和某些化学诱变剂，例如丝裂霉素C、5-溴尿嘧啶、甲基甲烷磺酸酯、氮芥子气和硝基呋喃。
关于诱变剂特异性的分子基础是不完整的，但很大程度上取决于诱变修复过程。
实际上，生产菌株对于一个特定的诱变剂的作用可能会难以控制的，轮流使用一些诱变剂是明智的，这些诱变剂经历不同的修复过程而发挥作用。
而且，突变剂的正确选择可以大大提高在诱变体中我们想要的诱变体的产生的频率，经过这样的方式，当对整个群体进行筛选的时候，鉴定的机会就会增加。
诱变率是基因控制的而且能够通过增变或者减变基因进行改变。
这些基因能够影响自发的或者诱导的突变性或者两者都有影响。
在筛选过程中，增变菌株是重要的由于其中有些增变菌株在诱变作用后能够使在每个存活的菌株中的诱变菌株的频率增高，这将提供了一个有效的输入。
在诱变作用后，环境条件能迅速影响整个的诱变频率和特异性。
因此，在诱变作用后在完全培养基上进行生长而不是基本培养基将会增大诱变体的产量。
大部分生物有一种机制就是与其他相似的但是基因不同的单体进行核物质交换，从而所形成的后代的基因型均不同于其亲代。
这个过程就是杂交，是促进可能的基因物质进行重组的一种重要方法。
诱变改变了一个有机体的基因，而重组或者杂交又重新安排了基因或者部分基因，而且将从一个或者两个有机体而来的遗传信息带到一个单独的有机体中。
杂交在植物和动物育种中广为采用，最近又被用来为很多生物工程过程生产改造的微生物。
原则上，杂交有两种表达方式：
真核生物的有性生殖和原核生物的准性杂交，对于一个特定的真核生物和大多数真核组织培养物不是纯性别的。
在生物工程背景下，真菌和细菌是杂交的主要对象。
3.4有性杂交
在有性杂交过程中，来自相反配体类型的单倍体核子被带入到一个细胞中（核配）：
核子最终融合形成一个二倍体核子然后经历减数分裂。
在减数分裂过程中，染色体被重新安排和组织从而使遗传元素重组（图3.2真核生物的减数分裂）。
这个同源重组对于产生新的基因型来说是很有效的。
这样，如果两个有机体有不同的n个基因，则发生在它们基因间的重组就会产生2n个基因型。
如果这两个菌株在上亿个碱基对中的只有12个分散在其上的碱基对是不同的，那么将会产生212个或者是4096个基因型。
在许多生物体中，存在的繁殖系统使有性杂交变得复杂，这个繁殖系统通过阻止自体受精的近系繁殖调节一个群体的远系繁殖。
通过这样的方式，繁殖系统促进了适宜遗传物质的不断混合。
繁殖系统对许多高等子囊菌纲和担子菌纲来说已有文件证明并且已被广泛用来蘑菇的商业化生产：
通过现代化工厂工艺，不同酵母菌株的有性杂交已被用来快速生产面包，提高蒸馏液体的酒精浓度和酿造特殊的啤酒，其中几乎所有的可溶性碳水化合物都被除去了。
3.5准性过程
目前在生物工程中应用的重要的有机体几乎没有明显的有性重组能力。
然而，通过准性机制可实现有限的重组。
准性过程包含在营养细胞中所有不进行减数分裂的基因重组过程。
准性过程利用许多细胞机制把不同来源的遗传物质带到一起。
这个机制在生物工程中有着实际的应用包括接合、转导、转化、有丝分裂重组和原生质体融合。
细菌中的接合是将遗传信息通过细胞与细胞的联接从一个细胞转移到另一个细胞的过程。
接合也能发生在真核生物中，这时单倍体配子融合形成二倍体合子（图3.3（a）准性过程机制）。
它是最为适用的转移方法之一并且对于种内和种间遗传转移来说是非常有用的。
在细菌中，这个过程通常是以质粒为中介的，甚至在涉及高频率重组株和相关菌株的例外情况下，一个外来遗传元素一旦是质粒，它就整合到染色体上。
接合转移伴随着DNA的复制并使转移的DNA整合到受体的基因组上。
尽管接合作用是革兰氏阴性菌的特征但是在革兰氏阳性菌中也证明有接合作用。
发现最早的细菌接合系统是大肠杆菌的两个不同菌株细胞间的联结和遗传物质经过性纤毛或者两个配子的一个所形成的微管进行转移。
形成纤毛的细胞包含有额外的遗传元素，F因子或者质粒，它们将环状的细菌DNA开裂并向另一个菌体细胞移动，在这个细胞里，两个基因组之间进行重组。
利用多种宿主的质粒就可以在大范围的革兰氏阴性菌之间进行基因的转移。
接合作用发现对于生产抗生素的Streptomyces和Nocardiaju菌株的改造有着很多实际应用。
转导是通过病毒载体将遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞并通过重组进行随后的合并（图3.3（b）准性过程机制）。
溶源性噬菌体将部分细菌基因组整合到自身的基因组上，转移这个细菌基因到另一个宿主细胞中并在合适的条件下，这个细菌DNA在新的细胞中进行表达。
英国皇家化学机构成功的利用转导作用对参与生产单细胞蛋白的Pruteenprocess的细菌进行改造。
对于动物细胞获得了感兴趣的猿猴病毒40（SV40）和鼠多瘤病毒而植物细胞是一种病毒传递物质，它有着特殊的价值。
这就是花菜花斑病毒（CMV），它是一个双链DNA分子，其宿主限定为十字花科。
还没有期望这个病毒系统在植物生物工程中有重要的应用。
转化，或者是遗传物质的单向转移，在这个过程中，来源于一个细胞的DNA被吸收并且被另一个细胞稳定的维持，转化在细菌中有广泛的作用（图3.3（c）准性过程机制）。
酵母和Streptomyces的转化正在广泛并迅速的发展，但是到现在为止在丝状真菌和植物与动物细胞中只有有限成功的转化。
转化的DNA可以经过体外处理或者操作包括诱变作用再导入到细胞中。
转化的一个主要的缺点是对于大多数细菌来说，一个群体中只有一小部分能够进行转化（大约为大肠杆菌的0.1%，高于大肠杆菌10-100倍的B.subtilis）。
在大肠杆菌中已经表明与小分子相比，大的质粒DNA分子的转化效率较低。
转化已成为基因工程的一个主要的方法，其利用质粒作为运输工具，将在本章的后面内容中进行讨论。
有丝分裂重组对于丝状真菌有着特殊的价值。
对于某些真菌，无性噬菌体是单倍体，少量的核子可以融合形成二倍体。
真菌无性循环过程中的二倍体菌体是无性核子在杂合条件下融合的结果。
这个过程由下列阶段组成：
在两个单倍体菌丝体之间形成异核体（一个单独的细胞质含有两个或多个不同的核子）；
少数相反核子发生细胞核融合（频率为10-6）；
在二倍体核子中进行有丝分裂交换使染色体间发生交换（频率大约为10-2每细胞核分裂）；
当二倍体核子被还原到单倍体状态下的时候，以大约每细胞核分裂10-3的频率进行单倍体化（图3.4有丝分裂性重组过程）。
这种有丝分裂性重组可进行可能的基因分析并在无性循环的有机体中进行可控制的育种。
对于重组的效率，与有性重组相比，有丝分裂性重组的效率很低。
已知这种形式的准性杂交在许多工业真菌中都有发生包括Penicilliiumchrysogenum、Aspergillusoryzase和Cephalosporiumacremonium。
由于商业机密的要求，这个系统在工业实践中使用的广泛性如何是难于了解的。
然而，不容置疑的是它在柠檬酸与青霉素生产菌中已得到成功的应用。
在高等植物与动物细胞组织培养物中也记录有有丝分裂性重组。
实现准性杂交最主要的就是将所要的细胞进行融合。
由于同种和异种间的不相容性存在有很多的障碍，然而通过特殊的试验程序，这种不相容性与物种障碍在如今的许多情况下将被克服，这些特殊的试验程序使细胞的原生质直接融合或者通过转化的方式用已分离的DNA感染细胞。
原生质融合细胞壁常常是不同有机体间发生重组的天然障碍。
如果通过制备原生质将这个障碍除去，并且认识到细胞膜相对含有类似的组成成分，那么就可以方便的对不同种生物的细胞质诱导融合并形成一个杂交细胞，以这样的方式使它们的基因进行重组。
微生物原生质的诱导融合这个领域具有很大的发展空间，在基础研究与应用研究方面已有快速积累的数据。
目前真菌和植物与动物细胞原生质融合与再生技术的成功使用，要感谢thecalier的许多研究工作，这个研究建立了原生质释放与细胞再生的技术基础。
现在就可以从大部分微生物细胞中常规制备原生质。
尽管已经有用机械和非酶催化的方法制备原生质的报道，但是研究的主要方向倾向利用溶菌酶进行原生质的分离。
这个snail消化的主要组成是酶、渗透稳定剂（osmoticstabilizer）和有机体。
酵母原生质体可以用蜗牛消化液的商业制品作为蜗牛酶或者硫酸酯酶来进行生产。
通常，多数溶菌酶商业制品对于从丝状真菌中制备原生质来说不是很有效的。
然而，许多其他的有机体，尤其是Streptomycesspp.和某些丝状真菌能够产生高效的溶真菌的活性。
在大多数情况下，生产菌消化细胞壁合成的酶复合物需要生长培养基中有诱导物质存在。
一种生产消化细胞壁酶的新方法是让生产菌在含有低于正常水平碳水化合物如葡萄糖和蔗糖的培养基上生长，但这个培养基要含有相对纯化的目标有机体的细胞壁。
生产菌的成功生长需要有合适的消化酶的产生，从而生产出重要的低分子量能量物质。
总体上，处于指数生长期的细胞比处于衡定生长期的细胞更容易生产原生质体，这说明在生长周期中细胞壁的化学成分发生了变化。
化学稳定剂也是重要的，在除去细胞壁后，它给原生质体提供渗透支持。
无机盐、糖和糖醇都被成功的用于维持被释放出的原生质体的完整性。
没有渗透稳定剂的话，被释放出的原生质体将很快破裂（burst）。
大部分原生质体能够生产出新的细胞壁，随后就能完全回转进行正常生长。
这样，如果在分离的融合原生质体间发生了有丝分裂性重组，那么随后的的回复就会导致一个遗传改变的和可进行繁殖的有机体。
相似或者不同菌株间天然原生质体融合的发生频率很低。
然而，引入作为促溶剂的聚乙二醇（PEG），融合的频率就可提高至少1000倍。
对PEG诱导的真菌原生质体的融合方法学研究表明在浓度为25-40%的溶液中用分子量为4000或6000的PEG是进行融合的最佳条件。
Ca+离子的存在对于获得高频率的融合来说是关键的。
实际上，融合作用起始于原生质体的凝集，这是由大量的（extensive）水解过程和聚集物（aggregate）的形成引起的。
随后原生质体收缩并高度变形。
在靠近的位点上，内膜蛋白粒子转位，随后聚集。
脂与脂的相互作用发生在表面去除了蛋白质的相邻膜之间，而且在钙离子的参与下脂分子又被重新组合。
这使得联结的膜的一小部分发生融合，小细胞质桥形成并不断扩大直至两个原生质体完全融合。
最近发展了一种细胞质融合的新的电子融合技术。
电子域的融合是一个快速并温和的过程，常常类似于细胞融合到巨大细胞中、无关的细胞融合到杂交细胞中及将物质包裹到细胞中那样。
细胞暴露在低水平、异种、高频电子域中，使细胞排成链。
采用直流电流在邻接的细胞膜打开微孔，使细胞物质混合，细胞融合。
这个过程还可改变允许物质通过的细胞外膜的渗透性，所包裹的基因的大小。
当来源于不同菌株的两个原生质体发生融合，所合成的细胞就是异核的由于所含有的核子来自不同的遗传物质。
在异核细胞中，不同基因型的单倍体细胞核之间会发生细胞核的融合或者二倍体化，这也发生在相同基因型的细胞核之间。
前者形成了一个二倍体杂合子而后者形成一个二倍体纯合子（homozygous）。
这个混合有单倍体和二倍体细胞核的融合原生质体就可以通过正常的繁殖过程再生出一个生长的有机体。
在生长期，这个二倍体细胞核分裂期间伴随偶然的（occasional）有丝分裂交换。
结果就会发生新的组合和连结，这些重组将赋予有机体正常性特征的某些优点。
通过这种准性过程产生了含有以前单倍体有机体的新二倍体菌株。
然而，常常会发生二倍体克隆的单倍体化。
由于有丝分裂性重组产生新的联接基团，一些新的单倍体菌株的基因型与它们亲代的任一方都不相同。
在丝状真菌中，在分生孢子形成过程中常会发生单倍体化，这时（where）分生孢子单体是单核的而且是单倍体。
当原生质体融合被用来对工业菌株进行改造，那么就会发生三个事件：
（a）产生可变的原生质；
（b）高频融合；
（c）融合的原生质再生为进行生长的克隆，实现二倍体化和单倍体化。
原生质融合看起来是改造Streptomyces菌株和其他抗生素生产菌的一种最令人信服的方法。
它可以生产出新的抗生素结构并且增加提高产量的基因的库容量。
最近两种类型的酵母进行了融合，再生的细胞经过繁殖以用作雪梨酒的生产。
由于大量的基因参与了这种改造，所以对这个系统来说，原生质融合技术比DNA重组技术更为可信。
在丝状真菌中的原生质融合及种间的原生质融合已成功的完成了菌株改造。
原生质融合好像是获得种间异核细胞的唯一途径，而丝状真菌中的重组不具有可以证实的有性循环。
从很多植物中都可以制备原生质，但是只有有限数量的原生质能够再生出细胞壁，进行分裂，最终分化为正常的植物。
许多重要的农作物（cropplant）都属于后者。
通过分离的植物原生质进行新的体细胞杂交体生产被认为是植物学的一个重要的技术改进。
在实际中，随着诱导融合，液体培养基中的原生质再生出细胞壁，并经过有丝分裂产生一个混合群体，这个混合群体由母细胞、同核融合产物和异核融合产物或者体细胞杂交体组成。
一般可通过遗传标记的表达、生理生长需求或者显微操作，对体细胞杂交体进行鉴定和恢复。
不同物种间的原生质融合有时候会产生杂交体但是这些杂交体是不能繁殖的，这个无法改变，它不能被整合到一个育种程序中。
如果这个杂交体能够进行传统的育种程序的话，体细胞杂交体在农作物改造中的作用才能实现。
原生质融合技术在农业实践中还没有带来新的变化。
然而，这必将在不远的将来实现而且打开了有创造的与有益的农业革新的新领域。
动物细胞也可以进行原生质融合，但是有机体无法完全生长。
尽管如此，原生质融合对于植物与动物组织培养物来说是改变遗传染色体的一种有价值的方法。
在基因间与区域间发生不常见的原生质融合，例如：
酵母原生质与鸡红细胞、动物与真菌异核体以及病毒与酵母。
然而，从这些实验中还没有获得有价值的遗传结果，但是它们确实暗示了未来可以将分类上距离较远的细胞进行融合使得特殊的遗传元素得到转移的可能。
细胞融合直接的细胞融合为单克隆抗体的形成建立了基础——是新型生物工程中最为活跃和成功的领域之一。
单克隆抗体是指从单一来源或细胞克隆获得的抗体，它只识别一种抗原。
卫生保健一直以来的一个领域就是制备疫苗以抵御疫病。
疫苗使机体建立起抵御屏障，如建立足够水平的抗体，当病菌以病毒的形式出现的时候待命的细胞进行生长并且产生抗体。
疫苗是一个复杂的实体由抗体混合物组成，，这个混合物过于复杂无法通过化学方法进行合成。
当把一个外源物质或者微生物（抗原）引入到一个脊椎动物体内，这时通过形成浆细胞，免疫应答反应发生（来自B-淋巴细胞），浆细胞分泌的（secrete）抗体能够以高度特异性识别、中和并且消除这个抗原。
这些抗体是无法分离的，所以传统的抗血清含有抗体的混合物。
然而，现在已经知道每个抗体来源于不同的B-淋巴细胞线和由它们衍生的浆
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