浅论GITR mRNA 在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平Word文件下载.docx
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[Abstract]Objective:
Tofindoutthecorrelationbetweenglucocorticoidinducedtumornecrosisfactorreceptor(GITR)andallergicrhinitis(AR).Methods:
Thirtythree(male12,average34yearsold)patientswithactiveAR,17ARpatientswithsymptomscontrolled(male8,average31yearsold),and24normalcontrols(male11,average28yearsold)wererecruitedinthestudy.TherelativeexpressionofGITRmRNAinperipheralbloodmononuclearcellswasdetectedbymeansofrealtimefluorescencequantitativePCRmethod.Results:
TherelativeexpressionsofGITRmRNAinthegroupofARpatientswithouttreatmentweresignificantlyhigherthanthatinthegroupsofARpatientswithsymptomscontrolledandnormalcontrols(,respectively),buttherewasnostatisticallysignificantdifferenceinrelativeexpressionofGITRmRNAbetweenthegroupsofARwithsymptomscontroledandnormalcontrol().Conclusion:
GITRmightbeinvolvedinthepathologicalprocessofAR.TheroleofGITRinprocessofARremainsfurtherinvestigation.
[Keywords]glucocorticoidinducedtumornecrosisfactor;
allergicrhinitis;
peripheralbloodmononuclearcell;
realtimequantitativePCR
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoidinducedtumornecrosisfactorreceptor,GITR)为肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员,又被称为TNFRSF18。
1997年,Nocentini等[1]在地塞米松处理的T细胞杂交瘤中克隆出GITR。
1999年以来,人类和鼠类的GITR配体(GITRL)也分别被克隆出来[2-3]。
Shimizu等报道GITR持续高表达于CD4+CD25+Treg表面,并能有效地消除Treg细胞的免疫抑制功能。
Patel等以抗GITR单抗注入关节炎鼠模型后,炎症恶化,同时伴有肿瘤坏死因子、干扰素、胶原特异性IgG1的升高。
此外,GITR单抗刺激同样可以加剧卵清蛋白(OVA)诱导的鼠哮喘模型的气道炎症,多种炎性细胞因子分泌增多。
在体外试验中,研究者观察到转录因子Tbet和GATA3的表达。
这些试验结果均提示GITR信号参与Th1和Th2的炎症反应。
因此GITR/GITRL在免疫调节中的作用,以及GITR与Th细胞的相关性受到免疫学研究者的高度关注。
但是近年来的相关研究结果多数是在动物细胞和动物模型上获得的,有关人类GITR/GITRL在免疫调节中的作用,特别是在变态反应疾病等病理情况下如何变化的研究报道不多。
因此,我们采用实时荧光定量PCR技术检测变应性鼻炎(allergicrhinitis,AR)患者外周血单个核细胞中GITRmRNA的相对表达水平,从而探讨其在变应性鼻炎中的表达变化以及其与变应性鼻炎发生、发展的相关性。
1材料和方法
研究对象
变应性鼻炎患者未治疗组按照中华医学会耳鼻喉科学分会2004年兰州会议变应性鼻炎诊断标准,选择2008年1月至2008年10月在镇江市第一人民医院就诊的23例患者,男12例,女11例,年龄12~56岁,平均34岁,均有变应性鼻炎典型症状,经过粉尘螨、屋尘螨、豚草等20种常见阳性变应原血清特异性IgE检测,至少一种为阳性。
正常对照组24例中,男11例,女13例,年龄16~42岁,平均28岁。
均无变应性鼻炎病史及哮喘、特应性皮炎等其他变应性疾病史,变应原血清特异性IgE过筛试验检测阴性。
临床缓解组为AR发作期患者经皮质类固醇激素鼻喷剂等药物治疗后临床症状缓解1月后复诊,并经表1疗效评分标准显示为有效或显效的患者。
AR临床治疗缓解组患者的筛选根据症状和体征记分评定疗效,记分方法见表1。
表1AR症状和体征评分方法 疗效评定标准:
治疗前总分-治疗后总分治疗前总分×
100%
计算值≥66%为显效,65%~26%为有效,≤25%为无效。
23位AR未治疗组经治疗后17例显效,3例有效,3例无效,20例有效或显效患者停药1月后有3例重新出现部分症状且评分低于显效标准。
我们去除无效及症状复发的,取17例(男8例,女9例,年龄12~48岁,平均年龄31岁)显效和有效且停药1月症状未复发的为临床缓解组。
主要试剂和仪器
Trizol(Invitrogen公司),Ficoll淋巴细胞分离液(天津灏洋生物技术有限公司),逆转录试剂盒(ToYoBo公司),SYBRGreenIRealTimePCRKit(杭州Bioer公司),rTaq酶、dNTP、10×
缓冲液、pMD18T(TakaRa公司),RotorGeneRG6000荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett公司)。
标本处理
取外周静脉血5ml经肝素抗凝后,按照Ficoll淋巴细胞分离液说明书操作分离PBMC,然后,加入1mlTrizol试剂裂解细胞,严格按照说明书操作提取PBMC中总RNA。
最后,利用逆转录试剂盒将总RNA逆转成cDNA,其中,在20μl的逆转反应体系中加入1μg总RNA为模板,合成的cDNA于-80℃冰箱保存备用。
引物设计及合成
利用primerprimer软件根据NCBI基因库中GITR和β肌动蛋白mRNA序列分别设计定量PCR引物,其中GITR:
上游5′GGGTCGGGATTCTCAGGTCA3‘;
下游5‘CGGGTTTCAAGAGCCCACAG3‘;
扩增片段103bp。
β肌动蛋白:
上游5‘CACGAAACTACCTTCAACTCC3‘;
下游5‘CATACTCCTGCTTGCTGATC3‘;
扩增片段262bp。
构建标准质粒
以上述制备的cDNA为模板,利用PCR扩增GITR和β肌动蛋白,反应体系均为10×
缓冲液2μl,μl,上下游引物(20μmol/L)各μl,cDNA模板1μl,rTaq酶(5U/μl)μl,ddH2O补足至20μl。
其中GITR反应条件:
94℃5min,94℃30s,63℃30s,72℃30s,共40循环。
β肌动蛋白反应条件:
94℃5min,94℃30s,56℃30s,72℃30s,共30循环。
以上述PCR产物分别与pMD18T载体进行TA克隆,并将筛选出来的阳性克隆稀释后作为标准质粒于-20℃冰箱保存备用。
制备标准曲线
以上述稀释的标准质粒作为模板在荧光定量PCR仪上采用四步法进行SYBRGreenⅠ实时定量PCR来制备标准曲线。
反应体系如下:
2×
SYBR混合物10μl,上下游引物(20μmol/L)各μl,Taq酶μl,cDNA或标准质粒1μl,ddH2O补足至20μl。
其中,GITR反应条件:
94℃5min,94℃30s,65℃30s,72℃30s,88℃8s,扩增40循环。
94℃5min,94℃30s,56℃30s,72℃30s,86℃8s,共30循环。
标本GITRmRNA相对表达量测定
将标本cDNA与标准质粒按照上述反应体系和反应条件同时进行扩增,根据标准曲线分别检测标本中GITR和β肌动蛋白mRNA拷贝数/μl,最后以β肌动蛋白为参照来校准目的基因GITR相对表达。
统计学处理
3组数据比较利用软件中KruskalWallisH检验,3组数据进行两两比较利用Nemenyi法检验,采用Spearman秩相关分析,以为差异有统计学意义。
2结果
AR未治疗组、AR临床缓解组和正常对照组GITRmRNA相对表达的比较
AR未治疗组、AR临床缓解组和正常对照组3组GITRmRNA相对的表达结果如图1所示。
3组间GITRmRNA相对表达水平比较差异有统计学意义(χ2=,)。
其中,AR未治疗组GITRmRNA相对表达水平明显高于临床缓解组和正常对照组(χ2=,;
χ2=,)。
而临床缓解组GITRmRNA相对表达水平与正常对照组相比较,差异无统计学意义(χ2=,)。
AR患者GITRmRNA相对表达水平与症状体征记分相关性分析
AR患者未治疗组GITRmRNA相对表达水平与症状体征记分相关性如图2所示,两者呈正相关(n=23,r=,)。
3讨论
GITR在鼠和人Treg细胞上组成性高表达[8-10],在小鼠体内,活化GITR信号,可遏制多克隆的或抗原特异性的鼠Treg细胞的抑制功能,而在人类,GITR信号并不干扰Treg的抑制活性,这显示GITR信号对Treg细胞的作用有着物种间的差异[11]。
然而,无论在小鼠还是人类,在受到刺激后,Th细胞表面GITR的表达均出现上调[11],且GITR信号与CD28的共刺激信号还有一定的协同作用[12],表明GITR信号对效应性T细胞具有明显的活化作用,参与了效应性T细胞的炎性反应。
变应性鼻炎是耳鼻咽喉头颈外科的常见病之一,临床上以鼻痒、喷嚏、鼻分泌亢进、鼻黏膜肿胀为主要特点,可分为常年性变应性鼻炎和季节性变应性鼻炎,其中约20%为季节性,40%左右为常年性,其余约40%为两者并存[13]。
该病发病率有逐年增加的趋势[13]。
细胞因子在气道变态反应疾病的免疫病因学中起着重要的作用,呼吸道上皮细胞是呼吸道炎症应答反应的主要调节者,前炎症因子、介质和环境因素如病毒、过敏、吸烟和空气污染等刺激使呼吸道上皮细胞产生生物活性介质,参与了免疫调节及炎性反应[14]。
综上研究,理论上讲GITR信号与变态反应疾病应该是有密切相关性的,而目前现有的证据仅停留在实验阶段。
尽管GITR在免疫调节中的作用仍未完全清楚,但本研究通过实时荧光定量PCR方法检测,显示AR未治疗组GITRmRNA相对表达水平明显高于临床缓解组和正常对照组,临床缓解组GITRmRNA相对表达水平与正常对照组相比较差异无统计学意义,提示变应性鼻炎患者体内由于GITR信号的活化抑制了Treg细胞,免疫调节功能下调,使得Th2细胞逃脱了抑制,从而造成了免疫紊乱,产生了一系列临床症状,而治疗后症状缓解的患者GITRmRNA表达水平恢复正常,Treg细胞发挥正常免疫调节功能,抑制了Th2细胞,从而抑制了变应性鼻炎的发病过程。
但这种表达水平的下降与症状缓解之间的联系是由GITR信号变化所引起,抑或由皮质类固醇激素对免疫系统的调节所引起,目前还不能肯定,因为尽管我们在使用皮质类固醇激素治疗后停药1个月,仍然不能完全忽视其在免疫反应中可能产生的作用。
同时,尽管本研究提示AR患者GITRmRNA相对表达水平与疾病的发生、发展有一定的相关性,但为证明GITR在变应性疾病中的作用,我们将利用GITR多克隆抗体进行进一步的实验[15]。
总之,本次研究认为GITR可能参与了AR的病理过程,从而为深入研究AR免疫调节病理机制奠定了一定基础,为临床治疗变态反应疾病提供了新的思路。
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