第二章微生物育种的原理和方法Word下载.docx
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1）紫外线诱变机理：
造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应
2）诱变过程中需要注意
光复活作用：
微生物等生物的细胞内存在光复活酶，光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物（此时的光复活酶没有活性），可见光光能（300-500nm）激活光复活打开二聚体，将DNA复原。
暗修复：
细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。
暗修复体系有四种酶参与反应。
紫外诱变的特点：
方便、诱变效果很好的常用诱变剂
由此说明紫外线照射引起微生物突体形成是一个复杂的生物学过程。
紫外线引起DNA结构的改变仅仅使微生物，于亚稳定状态，点亚稳定到稳定的突变体的形成需要“定时间和过程，所以在实际诱变工作中要采取某些措施避免以上的修复作用，要注意避光或加入某些物质，提高突变的频率。
因此，用紫外线进行诱变时，照射或分离均应在红光下进行。
3）化学诱变剂诱变机理：
5-溴尿嘧啶诱变——碱基类似物
机理：
与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应
注意的参数：
参数：
浓度、时间、缓冲液
三、诱变育种的基本过程
诱变育种的基本过程如下：
1）出发菌株的选择
A、一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。
菌株来源：
自然界直接分离到的野生型菌株
经历过生产条件考验的菌株
已经历多次育种处理的菌株
B、其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。
2）制备菌悬液
A、待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。
因为悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。
方法：
用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。
产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。
B、一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。
这样突变率高，重现性也好。
C、菌悬液的细胞浓度一般控制为：
真菌孢子或酵母细胞106107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。
菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。
3）合适诱变剂量的选择
在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。
就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。
致死率在70%-80%
4）诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。
一、菌种筛选的策略
筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求
1）初筛：
要力求快速、简便
复筛：
应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平
从菌体形态变异分析——初筛
A、平皿快速检测法
平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。
包括：
纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。
——定性或半定量用，大大提高筛选的效率——初筛
如：
微生物特异性平板检测方法
B、摇瓶培养法
摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。
二、特殊变异菌的筛选方法
✧组成型突变株
✧营养缺陷型突变株
✧抗阻遏和抗反馈突变型
✧抗生素抗性突变株
✧条件抗性突变
1、组成酶变异株的筛选
1）生产成本提高
2）原理：
控制酶合成的调节基因或操纵基因发生了变异，诱导酶转变成组成型酶
3）具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法
•恒化器法：
恒化器常被用于微生物的“驯化”，添加不能起诱导作用的低浓度底物，缓慢生长
•循环培养法：
利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。
•诱导抑制剂法：
加入诱导抑制剂如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷阻止某些诱导酶的合成
2、营养缺陷型（auxotroph）突变株
1）基本概念
野生型（wildtypestrain）:
从自然界分离的未发生突变的原始菌株
营养缺陷型（auxotroph）:
指原菌株由于发生了基因突变,致使合成途径中某步骤发生缺陷,而丧失了合成某些物质（氨基酸、维生素、碱基等）的能力
原养型（prototroph）:
营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株,其营养要求在表型上与野生型相同.
基本培养基（minimalmedium,MM）:
仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基
完全培养基（completemedium,CM）:
可以满足一切营养缺陷型菌株需要的天然或半合成培养基
补充培养基（supplementedmedium,SM）:
只能满足相应的营养缺陷型生长的需要的合成培养基
2）营养缺陷型（auxotroph）
A、一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。
营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段
B、表型判断的标准：
在基本培养基上能否生长
C、营养缺陷型的表示方法：
基因：
所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：
hisC-
（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）
表现：
同上，但第一个字母大写，且不用斜体：
HisC-
在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型
D、营养缺陷型突变株筛选步骤：
浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。
浓缩营养缺陷型菌株：
常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法
目的：
淘汰大量野生型，使营养缺陷型占的比例增加
筛选方法：
逐个检出法（点植法），影印培养法，夹层培养法等
逐个检出法
影印培养法
夹层培养法：
一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺陷型
获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物。
缺陷型类别的测定：
分类鉴定：
a:
氨基酸混合物,蛋白胨等------------氨基酸
b:
酵母浸出物,全营养-----------氨基酸,维生素,嘌呤,嘧啶
c:
维生素混合物--------------------维生素类
d:
核酸碱基混合液或酵母核酸----------------嘌呤,嘧啶类
嘌呤嘧啶缺陷型
氨基酸缺陷型
氨基酸-维生素缺陷型
缺陷型生长因子鉴定：
21种氨基酸组合设计
缺陷型生长因子鉴定
少数缺陷型的鉴定:
SM=MM+Trp
SM=MM+Met
Lys-Arg-
4,25=Met-1,14,18=Trp-
问题:
双缺的菌株如何鉴定?
E、营养缺陷型的应用
利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子
天冬氨酸激酶（AK）被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制，通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸，在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制，突变型能过量生产L-赖氨酸。
3）渗漏缺陷型突变株
遗传性障碍不完全的缺陷型,由于突变使它的某一种酶的活性下降而不是完全丧失
筛选方法:
MM培养基上长的慢而且菌落很小
用途:
解除途径中反馈抑制,也能在MM培养基上少量生长
3、抗阻遏和抗反馈突变型
1）抗阻遏和抗反馈突变型
都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。
选育结构类似物抗性突变株（结构类似物是指一些和细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构相类似的物质）
主要用于末端产物的积累
浓度梯度法
2）营养缺陷型回复突变株
当一个菌株突变失去某一个遗传性状后,经过突变又恢复其原有的遗传性状（野生的表型）
诱变诱变
原养型营缺型原养型
例
4、抗性突变菌株的筛选
1）抗性突变菌株的筛选方法
一次性筛选法：
一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。
（噬菌体抗性菌株、耐高温菌株）
2）抗药性突变型（resistantmutant）
特点：
基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。
正选择标记
表示方法：
所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示strr和strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性
在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。
抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。
5、条件抗性突变（conditionallethalmutant）
因环境不同，能表现为"
野生型"
菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。
在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。
温度敏感突变常用于提高代谢产物产量（致死或营养缺陷）
常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（temperaturesensitive）
表示，这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如25-30℃）下得到这种突变。
包括必需基因或非必需基因的突变
这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因
6、形态突变型（morphologicalmutant）
非选择性突变，突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分
例：
形成芽孢缺陷菌株，β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开
细胞水平上的形态突变，突变株的检出更加困难。
其它突变类型
毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用
中具有重要意义突变类型一般都不具有很明显或可直接检测
到的表型。
其突变株的获得往往需要较大的工作量。
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