总论第十章生化药物与生物制品分析0707Word文件下载.docx
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4.效价测定生物药物多数可通过含量测定,以表明其主药的含量。
但对酶类药物需进行效价测定或酶活力测定,以表明其有效成分含量的高低。
5.结构确证 在大分子生化药物中,由于有效结构或分子量不确定,其结构的确证很难沿用常规分析方法,往往还需用氨基酸序列测定等法加以证实。
生物药物质量控制的程序与化学药物质量控制的程序一致:
性状、鉴别、检查和含量测定。
第一节生化药物
(BiochemicalDrugs)
生化药物是从动物、植物及微生物中分离纯化所得的,以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的生化基本物质。
生化药物有两个基本特点:
其一,它来自生物体,来源复杂,有些化学结构不明确,分子量不是定值,多属高分子物质;
其二,它是生物体中的基本生化成分。
一、生化药物的种类
生化药物按照化学本质的不同,分为以下几类:
1.氨基酸及其衍生物类药物包括天然氨基酸、氨基酸混合物和氨基酸衍生物。
可由发酵制造,也可由蛋白水解制得。
ChP(2005)二部收载的有门冬氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、胱氨酸、脯氨酸等。
2.多肽和蛋白类药物这类药物是人体内的生理活性因子,在生物体内,浓度很低,但活性很强。
多肽参与调节生理功能,用于临床的多肽有催产素(9肽)、加压素(9肽)、胰高血糖素(29肽)、降钙素(9肽)等。
蛋白质类药物有水蛭素、鱼精蛋白、胰岛素、生长素、催乳素等。
3.酶类与辅酶类药物按其功能可分为:
助消化酶类、蛋白水解酶类、凝血酶及抗栓酶、抗肿瘤酶类和其它酶类等;
还包括部分辅酶类(辅酶Q)等。
如胃蛋白酶、胰蛋白酶、玻璃酸酶、尿激酶、凝血酶、辅酶Q10等。
4.糖类药物包括肝素、硫酸软骨素A和C、硫酸角质素、透明质酸等。
类肝素(酸性粘多糖)、壳聚多糖、灵芝多糖、黄芪多糖、人参多糖、海藻多糖、螺旋藻粘多糖等。
5.脂类药物包括多价不饱和脂肪酸(PUFA)、磷脂类、固醇类\胆酸类和卟啉类。
如亚油酸、卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、血红素、胆红素等。
6.核酸及其降解产物和衍生物类药物包括核酸类、多聚核苷酸、核苷、核苷酸及其衍生物。
例如免疫RNA、DNA(脱氧核糖核酸)、多聚胞苷酸、巯基聚胞苷酸、ATP和cAMP等。
二、鉴别方法
生化药物所涉及的鉴别方法比化学合成药物多,除理化方法外,还常常采用生化鉴别法和生物鉴别法。
(一)理化鉴别法
理化鉴别法包括化学鉴别法、光谱鉴别法和色谱鉴别法。
化学鉴别法是在一定的条件下,利用药物与某些试剂发生化学反应而呈色或生成沉淀或产生气体来进行鉴别的,如氨基酸类药物与茚三酮反应而呈色。
门冬酰胺在碱性条件下水解后产生氨气,能使湿润的红色石蕊试纸变蓝。
光谱鉴别法利用药物的UV或IR特征吸收进行鉴别,如细胞色素C是以含铁卟啉为辅基的结合蛋白,在磷酸盐缓冲液(pH7.3)中,还原型在550、520与415nm波长处有最大吸收;
氧化型在280、361、410与529nm波长处有最大吸收。
三磷酸盐腺苷二钠、门冬氨酸、色氨酸等氨基酸类药物采用IR鉴别,将供试品的IR图谱与对照品的IR图谱进行比对。
色谱鉴别法多采用TLC和HPLC法,利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间或肽图谱的一致性进行鉴别。
例1.谷氨酸(glutamicacid)片的鉴别:
取本品的细粉适量(约相当于谷氨酸5mg)加水5ml,加热使谷氨酸溶解,滤过,取滤液,加茚三酮约5mg,加热,溶液显蓝至蓝紫色。
例2.细胞色素C的鉴别:
取含铁量项下的供试品溶液1ml,置50ml量瓶中,用磷酸盐缓冲液(pH7.3)稀释至刻度,加连二亚硫酸钠约15mg,摇匀,测定,在520与550nm波长处有最大吸收,在535nm波长处有最小吸收。
例3.胰岛素的鉴别:
采用HPLC法,固定相为十八烷基硅烷键合硅胶(5μm),柱温40℃,流动相为0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(pH3.0)-乙腈(73∶27),检测波长214nm。
取胰岛素(猪或牛)对照品及供试品适量,分别加0.01mol/L盐酸溶液制成浓度为40U/ml的溶液,各取5μL进样,供试品主峰的保留时间应与同种属对照品主峰的保留时间一致。
(二)生化鉴别法
1.酶法尿激酶是专属性较强的蛋白水解酶,根据尿激酶能激活牛纤维蛋白溶酶原,使其转化成纤维蛋白溶酶,纤维蛋白溶酶具有较强的蛋白水解酶的能力,而纤维蛋白原在凝血酶作用下,转变成纤维蛋白凝块,此凝块在纤维蛋白溶酶作用下,水解为可溶性的小分子多肽,直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作为判断指标。
抑肽酶为蛋白酶抑制药,其鉴别是利用胰蛋白酶能专一地作用于对甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯的酯键,生成的水解产物使甲基红-亚甲蓝试液变成紫红色,抑肽酶抑制胰蛋白酶后,使水解反应无法进行,而不显紫红色。
例4.尿激酶的鉴别试验:
取浓度为20U/ml的供试品溶液,1ml加牛纤维蛋白原溶液0.3ml,再依次加入加牛纤维蛋白原溶酶溶液0.2ml,牛凝血酶溶液0.2ml,迅速振摇,立即置37℃±
0.5℃水浴中保温,记时,反应系统应在30~45s内凝结,且凝块在15min内重新溶解,当凝结块溶解时,气泡逐渐上升。
以0.9%氯化钠作空白,同法操作,凝结块在2小时内不溶。
2.电泳法用琼脂糖凝胶电泳法鉴别肝素,肝素是由硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘多糖,其水溶液带强负电荷,于琼脂凝胶板上,在电场作用下,向正极方向移动,与肝素标准品进行对照,其移动位置应相应一致。
例5.取本品与肝素标准品,加水制成浓度为2.5mg/ml的溶液,点样,电泳,取下凝胶板,用甲苯胺蓝溶液染色,用水洗去多余的染色剂,供试品与标准品所显斑点的迁移距离之比应为0.9~1.1。
3.样品脱盐后用等电点聚焦法测定基因工程药物的等电点往往是不均一的,即不是一个等电点,而是出现多条区带多个等电点。
这可能是信号肽表达不准确或样品提纯过程中经酸、碱处理等多种因素引起的。
对于同一个产品来说不管有几个等电点,但批与批之间必须一致,可表明其工艺稳定。
(三)生物鉴别法
生物鉴别法是利用生物体进行试验来鉴别药物的。
鉴别通常需用标准品或对照品在同一条件下进行对照试验加以确证。
如采用小鼠血糖法鉴别胰岛素,该法利用胰岛素的降血糖作用进行鉴别。
当大剂量给药时,小鼠血糖降低至一定水平即发生惊厥,迅速静注10%葡萄糖注射液,补充血糖,惊厥停止,说明是胰岛素所致低血糖而引起的惊厥。
玻璃酸酶是蛋白分解酶,可促使皮下输液或局部积贮的渗出夜和血液的扩散,以利于吸收,玻璃酸酶的鉴别是利用结缔组织基质中的玻璃酸具有较大的粘滞性,对体液扩散有阻滞作用,在动物皮内注射玻璃酸酶,通过对粘多糖玻璃酸的解聚作用,能加速染色剂亚甲蓝的扩散和吸收,使皮内注射的亚甲蓝和玻璃酸酶的蓝色圈大于单独注射亚甲蓝的蓝色圈,根据扩散作用来鉴别玻璃酸酶。
例6.胰岛素的鉴别试验取本品适量,用pH为2.5~3.0的水配制成5U/ml的溶液,在20~30℃取体重为20~24g的小鼠5只,按0.25ml/20g体重的剂量皮下注射胰岛素溶液,2h内至少应有4只小鼠发生惊厥。
立即给惊厥的小鼠腹腔10%葡萄糖注射液1ml,应能使惊厥停止。
(四)肽图鉴别法
肽图谱分析(PeptideMapping)是基因工程多肽药物质量控制的重要手段之一。
该方法是根据蛋白质分子量的大小以及氨基酸组成特点,使用专一性较强的蛋白水解酶,一般为肽链内切酶(endopeptidase),作用于特殊的肽链位点,将蛋白质裂解成较小的片断,经分离检测形成特征性指纹图谱。
肽图谱对每一种蛋白质来说都是特征和专一的,可用于鉴别蛋白质一级结构的完整性和准确性;
也可根据同种产品不同批次肽图的一致性,考察工艺的稳定性。
常用的消化试剂有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、溴化氰等,常用的检测技术有HPLC、CE和MS。
ChP(2005)三部收载两种肽图检查法,第一法为胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法,第二法为溴化氰裂解法。
1.胰蛋白酶裂解-RP-HPLC法取供试品溶液(1mg/ml)和对照品溶液(1mg/ml),分别用1%碳酸氢铵溶液充分透析,按1∶50(mg/mg)加入0.1%蛋白酶溶液,在37℃保温24h后,按1∶10加入50%醋酸溶液,离心(10000r/min)5min,精密量取上清液(或用0.45μm滤膜滤过)100μL,分别注入液相色谱仪,梯度洗脱,记录色谱图。
将供试品溶液和对照品溶液的图谱进行比较,即得。
2.溴化氰裂解法取供试品溶液和对照品适量,(约相当于蛋白质50μg),用水透析16h,冷冻干燥,加溴化氰裂解液(0.3g/ml)20μL溶解,室温放置24h,裂解物加水180μL,再冷冻干燥。
冻干的裂解物用水复溶至适当浓度。
照SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法进行电泳,用银染法染色。
三、检查
生化制药主要有六个阶段:
(1)原料的选择和预处理;
(2)组织及细胞的破碎;
(3)从破碎的细胞中提取有效成分制成粗品;
(4)采用多种生化技术从粗品中将目的物精制出来;
(5)干燥及保存;
(6)制剂。
制备生化药物所用的原料比较复杂,脏器生化药物从动物的组织、器官、腺体、体液、分泌物以及胎盘、毛、皮、角和蹄甲等提取的药物,如脑磷脂、脑活素、多种脑啡肽来自于大脑,辅酶A来自于肝脏,胃蛋白酶来自于胃,硫酸软骨素来自于骨;
生长激素、催产素来自于脑垂体,胰岛素来自于胰腺,尿激酶来自于尿,组氨酸、赖氨酸、精氨酸和水解蛋白来自于血,人工牛黄来自于胆汁等。
提取纯化工艺简单,如甲状腺是取猪、牛、羊等食用动物的甲状腺体,除去结缔组织与脂肪,绞碎、脱水、脱脂,在60℃以下干燥,研细制成。
有效成分在生物材料中浓度很低,杂质的含量相对比较高,因此,杂质检查和安全性检查就显得非常重要。
生化药物应保证符合无毒、无菌、无热源、无致敏源和降压物质等一般安全性要求。
(一)杂质检查
生化药物的杂质检查包括一般杂质检查和特殊杂质检查。
一般杂质检查主要有氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等检查。
其检查的原理及方法与化学药物中的一般杂质检查相同。
特殊杂质检查主要检查从原料中带入或生产工艺中引入的杂质、污染物或其它成分。
1.氨基酸类药物中其他氨基酸的检查氨基酸类药物可以通过化学合成法、发酵法和酶生物合成法制备,制备中有可能引入其它氨基酸,需要检查其他氨基酸,检查方法通常为TLC法。
例7.天门冬氨酸中其他氨基酸的检查取天门冬氨酸供试品溶液(10mg/ml)和天门冬氨酸对照品溶液(0.05mg/ml)各5μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-水-冰醋酸(2∶2∶1)为展开剂,展开后,晾干,在90℃干燥10min,喷以茚三酮溶液(1→50),再在90℃干燥10min,立即检视。
供试品溶液如显杂质斑点,与对照品溶液的主斑点比较,不得更深。
2.多肽和蛋白类药物中有关肽类或有关蛋白的检查胰岛素是人、猪、牛等动物的胰脏β细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白,人胰岛素的制备可以由猪胰岛素结构改造而成,也可以用基因工程大肠杆菌重组合成。
从猪胰中提取的过程为将猪胰脏绞碎提取,经浓缩,盐析、脱水得粗制品;
将粗制品溶解,再经醋酸锌沉淀,一次精制脱水得锌胰岛素结晶性粉末。
制备过程中引入的有关蛋白和大分子蛋白需加以控制,对于有关蛋白的检查,ChP采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,BP采用HPLC法;
对于大分子蛋白的检查,ChP和BP均采用分子排阻色谱法。
[活化],[透析]
[分级盐析],[透析]取]
[绞碎],[提取]
[树脂柱洗脱]
3.酶类药物中其他酶的检查糜蛋白酶是从牛、猪胰脏中提取出的一种蛋白水解酶,方法为:
猪胰脏提取液滤饼酶液
[盐析],[透析],[干燥]
洗脱液糜蛋白酶。
胰蛋白酶也存在于胰脏中,在提取糜蛋白酶时易带入,所以,糜蛋白酶中要检查胰蛋白酶;
同样,制备胰蛋白酶时也易引入糜蛋白酶,胰蛋白酶也要检查糜蛋白酶。
检查方法为生化法,原理为:
胰蛋白酶专一地作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的羧基组成的肽键、酰胺键和酯键,选用对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯为底物,酯键被水解生成酸可使甲基红-亚甲蓝试液变成紫红色。
呈色速度与胰蛋白酶的量及试剂纯度有关,故与胰蛋白酶对照品作比较,控制其限量不大于1.0%用每1mg效价不得低于2500单位的胰蛋白酶作对照品。
例8糜蛋白酶中胰蛋白酶的检查
吸取供试品溶液(10mg/ml)50μL与0.1%胰蛋白酶对照品溶液5μL,分别置白色点滴板上,各加对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐试液0.2ml,放置后,供试品溶液应不呈现紫红色或呈色时间晚于胰蛋白酶对照品溶液(1%)。
4.糖类药物的检查山梨醇、甘露醇和肝素是常见的糖类药物。
山梨醇是由葡萄糖经高压氢化还原后通过离子交换树脂处理精制而得。
ChP和USP规定山梨醇中检查还原糖和总糖。
还原糖是指制备过程中未被氢化完全的葡萄糖,总糖是指制备过程中未被氢化完全的葡萄糖及葡萄糖原料本身带入的不纯物(糊精、淀粉、其他糖类),经水解成单糖后的总含糖量。
还原糖的检查采用重量法,原理为葡萄糖与碱性酒石酸铜试液反应,生成氧化亚铜,洗涤,干燥至恒重,重量不得超过规定。
总糖的检查需先将供试品加酸回流,使不纯物水解成单糖后按上述重量法检查。
肝素在动物体内是与蛋白质结合成复合物的形式,在提取时一般采用酶解或盐解的方法将蛋白质除去。
肝素中蛋白质及核苷酸的检查是利用肝素与蛋白质及核苷酸的紫外吸收特征的差异,采用紫外分光光度法进行检查的。
蛋白质及核苷酸分别在260nm和280nm波长处有吸收峰,而肝素在220~300nm波长处无吸收。
例9肝素钠中吸光度检查取本品,加水制成每1ml中含4mg的溶液,在260nm波长处测定吸光度不得大于0.20,在280nm波长处测定吸光度不得大于0.15.
(二)安全性检查
由于生化药物的性质特殊,生产工艺复杂,易引入特殊杂质,故生化药物常需做安全性检查,如热原检查、过敏试验、异常毒性试验等。
1.热原与细菌内毒素检查法
ChP中的热原检查采用家兔法,即将一定剂量的供试品,静脉注入家兔体内,以其体温升高的程度,判定该供试品中所含热原是否符合规定,是一种限度试验法。
细菌内毒素主要来自革兰氏阴性细菌,主要成分为脂多糖,对人有致热反应,甚至导致死亡。
细菌内毒素检查采用鲎试剂法,利用鲎试剂与内毒素发生凝聚反应进行检查,判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。
2.异常毒性试验
异常毒性试验是将一定剂量的药物经注射或口服给药小鼠,在规定的时间内,观察其急性毒性反应。
反应的判断以试验动物死亡与否,判断供试品是否符合规定。
在此剂量条件下,一般供试品不应使试验动物中毒致死;
如果出现试验动物急性中毒而死亡,则反映该供试品中含有的急性毒性物质超过了正常水平,因此,本试验又称异常毒性检查法。
3.过敏试验
过敏试验是检查异性蛋白的试验。
药物中若夹杂有异性蛋白,在临床使用时易引起病人多种过敏反应,轻者皮肤出现红斑或丘疹,严重者可出现窒息、发结、血管神经性水肿、血压下降,甚至休克和死亡。
因此,有可能存在异性蛋白的药物、应作过敏试验。
过敏反应检查法是观测供试品对豚鼠腹腔注射(或皮下注射)和静脉给药后的过敏反应。
将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内,间隔一定时间后静脉注射供试品进行攻击激发,观察动物出现过敏反应的情况,以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。
例10细胞色素C的过敏试验细胞色素C是蛋白制剂,在制备中可能掺入少量杂蛋白,为保证使用安全,ChP规定细胞色素C溶液及细胞色素C注射液应做过敏试验。
方法如下:
取本品适量,加灭菌注射用水稀释成每1ml中含细胞色素C7.5mg的溶液,作为致敏液与供试品溶液。
另取体重为250~350g的健康豚鼠6只,连续3次隔日腹腔注射致敏液0.5ml时,2周后,再自股(耳)静脉注射供试品溶液1时,注射后15min内,均不得出现过敏性反应。
如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽三声等现象中的两种或两种以上者,或有抽搐、虚脱或死亡等现象之一者,应判为阳性。
4.降压物质检查法
降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质,包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。
在用动物脏器或组织为原料制备生化药物的过程中,正常组织内存在的组胺及部分氨基酸脱羧形成的组胺、酪胺等胶类物质,均为这类杂质的来源。
以组胺为代表的胺类,具有剌激支气管、肠管平滑肌,扩张毛细血管及人类小动脉的作用,注入体内能导致人、狗、猫或猴的血压下降。
临床上注射染有此类降压物质的注射液后,将引起面部潮红、脉搏加速和血压下降等不良反应。
因此,除了从生产工艺上采取有效措施以减少可能的污染外,对有关药品中的降压物质进行检查并控制其限度是十分必要的。
ChP采用猫(或狗)血压法检查法,比较组胺对照品与供试品引起麻醉猫血压下降的程度,以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定。
5.无菌检查法
无菌检查法系指用微生物培养法检查药品、敷料、缝合线、无菌器具等是否无微生物污染的一种方法。
由于许多生化药物是在无菌条件下制备的,且不能高温灭菌。
因此,无菌检查就更有必要。
无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行,其全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染。
单向流空气区与工作台面,必须进行洁净度验证。
四、含量测定
生化药物的含量测定方法主要有理化法、生化法和生物检定法。
理化法适用于化学结构明确的小分子生化药物或经水解变为小分子药物的测定,含量常常用百分含量表示;
生化法和生物检定法多用于分子量较大的酶类和蛋白质类药物的含量测定,多用生物效价或酶活力单位表示测定结果。
(一)理化法
理化法包括化学分析法、分光光度法和色谱法以及其他方法,如门冬酰胺采用凯氏定氮法测定含量,甲状腺粉采用氧瓶燃烧法测定含量。
1.滴定分析法
利用氨基酸类药物分子的氨基的碱性,可采用非水溶液滴定法测定含量,如L-门冬氨酸、L-丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、组氨酸。
谷氨酸利用羧基的酸性采用中和滴定法测定含量。
甘露醇和山梨醇均采用碘量法测定,甘露醇与高碘酸发生定量氧化还原反应,剩余的高碘酸及生成的碘酸再与碘化钾作用,生成游离碘,用硫代硫酸钠液滴定。
CH2OH(CHOH)4CH2OH+5HIO4→2HCHO+4HCOOH+5HIO3+H2O
2HIO4+14KI+7H2SO4→8I2+7K2SO4+8H2O
2.分光光度法
生化药物一般采用比色法和UV法测定含量。
如硫酸软骨素为大分子酸性粘多糖类药物,其结构中的双糖单位分子中含一分子氨基己糖,采用Elson-Morgan比色法测定含量。
先酸水解供试品,生成氨基己糖,然后在碱性条件下与乙酰丙酮反应,生成色原物质,与对二甲氨基苯甲醛盐酸醇溶液反应产生红色,以盐酸氨基葡萄糖为对照品,于525nm波长处测定吸光度。
肌苷、胞磷胆碱钠、细胞色素C等药物采用UV法直接测定,以
值计算含量,测定细胞色素C时应注意,还原型细胞色素C在550nm波长处有最大吸收,峰形异常尖锐,在测定时要求仪器的狭缝应小于1nm,以减少杂散光影响,并应在550nm波长附近,每间隔0.5nm找出最大吸收波长,否则会给测定带来较大的误差,
为23.0。
3.HPLC法
HPLC法适用于高沸点、大分子量、热稳定性差的生物活性物质的分析,常以具有一定pH值的缓冲溶液作为流动相,常温操作,分析环境与生理环境相似,因而具有温和的分析条件与良好的生物兼容性,有利于保持生物大分子的构象和生理活性等特点。
HPLC法可以用于氨基酸及其衍生物、多肽、蛋白质、糖类、卟啉、核酸及其降解产物的分离与测定。
(1)反相高效液相色谱法(RP-HPLC)
可以对氨基酸、肽、蛋白质、多糖进行分析。
固定相尽量选择球形全多孔硅胶键合相,分子量较小的药物选用C18烷基硅胶键合相,分子量较大的药物选用C8烷基硅胶键合相。
流动相选用乙腈-水(或缓冲溶液)、甲醇-水(或缓冲溶液)。
如复方氨基酸注射液、辅酶Q10等一般按外标法以峰面积计算各种氨基酸的含量。
例11.三磷酸腺苷二钠的含量测定三磷酸腺苷二钠(adenosinedisodiumtriphosphate)的含量是通过测定总核苷酸和三磷酸腺苷二钠的重量比来控制的。
三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)不稳定性,易降解为二磷酸腺苷(adenosinediphosphate,ADP)至一磷酸腺苷(adenosinemonophosphate,AMP),在生产、贮存与销售期过程中,即使总核苷酸的量不变,ATP的重量比会随时间的延长而逐步下降,ChPATP-2Na含量是通过测定总核苷酸的量和ATP-2Na的重量比来控制的。
总核苷酸的量采用紫外分光法度法测定,ATP-2Na的重量比采用HPLC法测定。
总核苷酸测定取供试品加0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)使溶解并制成浓度为20μg/ml的溶液,在259nm波长处测定吸光度,按C10H14N5Na2O13P3吸收系数(
)为279计算总核苷酸的量。
ATP-2Na重量比测定色谱柱为HypersilODS(4mm×
125mm,5μm),流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠35.8g,磷酸二