整理质粒DNA提取的影响因素的研究Word文档格式.docx

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plasmidDNA;

extracting；

alkalinelysismethod

引言　

质粒（Plasmid）是一种染色体外稳定的遗传因子，大小从1kb~200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中.质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,具有自主复制和转录能力[1]，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

它可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细胞中进行增殖和表达,是分子生物学试验中常用的工具［2].质粒DNA是种基因运载工具，在分子生物学中有着极为广泛的应用前景,而质粒DNA的分离提取是分子生物学试验中最基本的工作。

目前细菌中提取质粒DNA多采用碱裂解法[3-7]，该法操作简便，其基本原理为:

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；

蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来.质粒DNA的提取效率和纯度直接影响到分子生物学试验的成功与否，比如酶切、连接、大肠埃希菌的转化、PCR扩增等。

质粒提取的得率和质量与很多因素有关,其中最主要的因素有宿主菌的种类和培养条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、所用的主要试剂，抗生素、吸附柱的吸附量等。

在此实验中，主要研究主要试剂对质粒DNA提取的影响[8]。

其中溶液Ⅰ，加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。

EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。

此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率.

溶液II中,NaOH是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilaye（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。

SDS也呈碱性，但如果只用SDS,达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。

这一步操作要注意两点:

第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；

第二,必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

对于溶液Ⅲ，SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来.溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。

同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀.2M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。

基因组DNA一旦发生断裂，小于100kb的片断,就不容易与PDS共沉淀。

所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡,否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。

这一步操作混合均匀后在冰上放置,可以使PDS沉淀更充分。

1　材料与方法

1.1　材料

1．1．1实验菌株使用菌株为大肠杆菌DH5α，氨苄培养液中培养。

1．1．2主要试剂氨苄青霉素；

RNase酶；

苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）;

无水乙醇；

冰冷70%乙醇；

醋酸钾；

醋酸钠；

溴化乙锭EB;

LB培养基：

（蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl10g,溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7。

2，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟）；

溶液Ⅰ：

50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8。

0）；

溶液Ⅱ：

0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS（需要新鲜配制）；

溶液Ⅲ（3mol/LNaAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，调pH至4。

8,并高压灭菌）;

TE缓冲液（pH8.0）：

10mmo/LTris·

Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0），高压灭菌后储存于4℃冰箱中；

10×

酶切反应缓冲液；

6×

上样缓冲液。

1。

2　方法

1．2．1　质粒DNA的提取［3]采用4种不同的方法进行质粒DNA的提取，所用具体试剂见表1：

①将pBSSK/DH5α接种在含100μg/mLAmp的LB固体培养基中，37℃培养12~24小时。

②用无菌牙签挑取单菌落接种到5mL含100μg/mLAmp的LB培养液中，分别37℃震荡培养过夜。

③吸取1。

5~3ml培养液于离心管中，在4℃、12000r/min离心1min,弃去上清，收集菌体。

④加入100μL的溶液Ⅰ,在旋转混合器上剧烈震荡,使菌体充分悬浮，室温条件下静置5min。

⑤加入200μL新配制的溶液Ⅱ,温和上下颠倒离心管2~3次，以混匀内容物,冰浴条件下静置5min.

⑥加入150μL的溶液Ⅲ，上下颠倒混匀数次（不可震荡），冰浴条件下静置5min。

⑦4℃条件下12000r/min离心10min，将上清液移置新的离心管中（约为400μl）。

⑧.加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（400μl），充分震荡混匀，室温条件下12000r/min离心5min。

⑨吸取上层水相移置新的Ep管中（尽可能用200μl的移液器进行转移，注意不要吸入中间的变性蛋白质层）。

⑩加入1/10体积量（约40μl）3mol/LNaAc（pH5。

2），再加入2。

5倍体积（约1mL）的预冷的无水乙醇.

⑪放入—20℃冰箱中静置30min,然后在4℃、12000r/min离心15min。

⑫弃去上清液,加入1mL预冷的70％乙醇,上下颠倒混匀数次，4℃、12000r/min离心5min，洗涤沉淀，以除去盐离子。

⑬小心弃去上清液,倒置于滤纸上使所有液体流尽,沉淀物在室温下自然干燥。

然后加入50μlTE缓冲液溶解沉淀（如果是Pet28c系列的质粒用30μlTE）。

⑭加入2μl的2mg/ml的RNase酶，37℃保温20～30min。

⑮取5μl的质粒与2μl的6×

上样缓冲液混合后，在0。

7％的凝胶上电泳检测。

⑰将所获得的其余质粒DNA样品置于-20℃冰箱中保存备用。

表1　4种不同的方法进行质粒DNA的提取所用试剂

Table1FourdifferentmethodsofplasmidDNAextractionreagentsused

组别

1234

溶液Ⅰ

溶液Ⅱ

溶液Ⅲ

50mM葡萄糖，50mM葡萄糖,50mM葡萄糖，

25mMTris-HCl（pH8.0），　　LB液体培基25mMTris—HCl（pH8。

0），25mMTris—HCl（pH8.0），

10mMEDTA（pH8。

0）　10mMEDTA（pH8。

0）10mMEDTA（pH8.0）

200MmNaOH,1%SDS200MmNaOH，1%SDS200MmNaOH，1％SDS1％SDS

醋酸钾（pH4.8）　醋酸钾（pH4。

8）　醋酸钠（pH4.8）醋酸钾（pH4.8）

1．2．2质粒DNA的定量及杂质检测［10］　各取样品10μL稀释200倍后,分别测定OD260和OD280值,若OD260/OD280〉2.0，表明DNA中含有RNA杂质。

若OD260/OD280<

1.6，表明样品中含有蛋白质。

1．2．3　质粒DNA的电泳检测[11］　分别取四种方法得到的质粒DNA5μL，与6×

上样缓冲液混合,然后在0。

8%琼脂糖凝胶上电泳，采用5V/cm的电压,电泳3h，EB染色，取出凝胶置紫外灯下检测，拍照。

2结果与分析

2．1质粒DNA的定量及杂质检测　

表2结果显示：

方法1与方法2所得OD值几乎一样，由此可知，是否使用溶液Ⅰ对实验基本上没有影响，在没有溶液Ⅰ的情况下，可用LB液体培养基代替。

方法4得出的D260/D280的值为2，表明方法4提取的质粒DNA中可能会混有杂质RNA.方法3所得D260/D280〈1。

6，表明样品中含有蛋白质杂质，表明用醋酸钠代替醋酸钾,蛋白质大部分未被沉淀，由此可知，醋酸钾能够使大部分蛋白质沉淀。

表2　不同方法提取的质粒DNA的吸光值

Table2PlasmidDNAextractedwithdifferentabsorbance

OD值

1234

OD260

OD280

OD260/D280

0。

0350。

0330。

0110。

006

0210.0200.0100.003

6671。

6501。

1002。

000

2．2质粒DNA电泳检测　

采用四种不同的方法抽提质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳后通过电泳图可以看到:

方法1，2，3所得条带亮度大致相同。

表明，将溶液Ⅰ用LB液体培养基代替，结果得到的质粒DNA的量并无影响，将醋酸钾用醋酸钠代替并不影响质粒DNA的量.方法4所得条带亮度较暗，即得到质粒DNA的量明显偏少,表明溶液Ⅱ中的NaOH直接关系到所提取质粒DNA的量，裂解细菌主要试剂是NaOH，而不是SDS，若只用SDS也能抽提得到少量质粒DNA，见图1。

1234

图1　四种方法得到的质粒DNA电泳图

Figure1FourmethodsbyelectrophoresisofplasmidDNA

注1：

50mM葡萄糖，25mMTris—HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0）；

200MmNaOH，1%SDS;

溶液Ⅲ：

醋酸钾

2：

溶液Ⅰ用LB液体培养基代替3：

溶液Ⅲ醋酸钾用醋酸钠代替4：

溶液Ⅱ只用SDS

3　讨论

3．1主要试剂对质粒DNA提取的影响

碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液Ⅰ使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2+和Mg2+螯和,抑制DNase的活性，溶液II裂解细菌，变性蛋白质和少量质粒，溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀，质粒DNA复性［12].因此如果实验中缺少了溶液Ⅰ，用LB液体培养基代替之也可以，只要在短时间内完成质粒的提取即可。

裂解细菌主要是溶液II中的NaOH，而不是SDS，所以叫碱裂解法,若只用SDS也能抽提得到少量质粒,这是因为SDS也是碱性的，但是它只能破坏少量细菌的细胞膜。

另外NaOH要从浓溶液新鲜稀释制备，可能会由于空气中的CO2与NaOH作用而使其碱性降低，从而使其裂解细菌的能力减弱。

这一步操作要主要:

一是放置时间不能过长，因为在这样的碱性条件下,基因DNA片段会慢慢断裂［13]。

二是，混匀动作要轻柔，因为在强碱会导致基因组DNA片段的断裂，剧烈的机械振动也会使基因组DNA断裂。

大量基因组DNA片段混入会影响质粒DNA提取的纯度［9］。

加入溶液Ⅲ后，会有大量的沉淀生成，这是由于SDS与蛋白质结合后，SDS与醋酸钾生成了PDS，PDS的溶解度要比SDS低的多,从而使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀了.若用醋酸钠代替醋酸钾，所得到的蛋白质沉淀就会大大减少［12]。

3．2其他影响质粒DNA提取的因素

3．2．1宿主菌种类质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中,多数情况下我们是从大肠杆菌中提取质粒.大肠杆菌的菌株不同会影响质粒提取的质量.从宿主菌如DH5α和TOP10中可以得到高质量的质粒DNA.HBl01和它的衍生菌株,如TG1和JM系列会在裂解时产生大量的糖类，如果没有完全去除，将抑制后续实验中的酶活性，影响质粒DNA提取的质量［13］。

另外,有些菌株有非常高的内切酶活性，会降低DNA的得率。

因此推荐使用DH5α和TOP10来提取质粒DNA。

3．2．2培养时间从固体培养基平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中（含有相关抗生素的液体培养基中）,振荡培养12—16小时.不应超过16小时，因为这时细胞开始裂解,使得质粒的得率降低，也会导致质粒丢失或质粒变异。

3．2．3抗生素在菌株的各生长阶段都应加入抗生素筛选。

现在用的许多质粒都不含有在细胞分裂时确保平均分配的par位点，无质粒的子细胞在无抗生素时复制速度远大于含质粒的细胞。

3．2．4质粒扩增氯霉素能抑制宿主细胞蛋白质和DNA的合成，但对松弛型质粒的复制没有影响。

因此，在细菌培养液中加入氯霉素可提高松弛型质粒的拷贝数。

由于氯霉素抑制了宿主细胞蛋白质和DNA的合成，从而抑制了染色体的复制，但质粒复制所用的酶半衰期较长，故质粒仍可继续复制,这样既可增加质粒产量,又可降低细胞的数量，使细菌裂解液的粘度降低而便于操作［13］。

常用于扩增的氯霉素浓度为170ug/ml.

3．2．5质粒拷贝数质粒拷贝数常用的定义是指生长在标准的培养基下每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目.每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的起始复制机制。

按照复制性质,可以把质粒分为两类：

一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1—2个质粒,如F因子；

另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细胞内一般有20个左右质粒，如ColEl质粒。

一般分子量较大的质粒属严紧型,分子量较小的质粒属松弛型。

质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型.

3．3注意事项

在质粒DNA提取过程中以及其进行电泳检测时要注意一下方面，否则会导致质粒DNA提取失败或者电泳后无条带出现.若提取大肠杆菌质粒DNA后跑琼脂糖电泳无条带出现。

可能的原因有：

①使用处于对数期的新鲜菌体，因为老化菌体会导致开环质粒的增加。

②尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量.③裂解时间不要过长，加入溶液Ⅱ后裂解时间不应超过5分钟.④加入SDS-碱后不要在冰上超过5分钟，因为此步骤的目的是使细胞内物质释放，蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性，时间过长，会导致加入中和裂解液如酸性醋酸钾后，仍无法使质粒DNA复性.导致提取失败。

⑤NaOH要从浓溶液新鲜稀释制备，可能会由于空气中的CO2与NaOH作用而使其碱性降低,从而使其裂解细菌的能力减弱。

⑥在加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，由于质粒DNA已从细胞中游离出来，所以此时的操作一定要轻柔，切不可使用混匀器，否则会导致DNA断裂［14].⑦在每一步转移上清时,不能贪多,中间层不能取,否则会使提取的质粒DNA中蛋白的含量增加，影响后续实验的结果。

⑧加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖倒翻摇动4～5次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA[15].⑨进行电泳时，DNA样品加入量要适当。

过多的量会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散;

太少可能不会出现电泳条带。

⑩为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带,加入1μlRNA酶，将管置50℃水浴箱内30min,消化RNA.

3．4其他提取质粒DNA的方法

碱裂解法作用强烈,质粒的共价闭合环状DNA构象易被破坏，但该种方法提取的DNA纯度较高。

除了碱裂解法提取质粒DNA，常用的还有煮沸法，酚/氯仿法，试剂盒法[16］。

煮沸法较为快速简便，但收获的质粒DNA的含量较低，而且除蛋白质很不彻底,煮沸法只用于经氯霉素处理的培养物，未处理的培养物裂解后过于粘稠不利操作。

酚/氯仿提取法所得质粒DNA具有较高浓度、纯度也可以，具有较高可行性，是常用的方法。

但该方法的缺点在于酚/氯仿提取法中，用苯酚和氯仿进行抽提常常需要离心多次,使质粒DNA损失较大,产率低，操作步骤繁琐。

而且饱和酚和氯仿均有很大毒性和挥发性气味，在学生的教学试验中带来诸多危险和不便［16]。

试剂盒采用碱裂解法和离心吸附柱提纯，制备DNA纯度最高，操作简便。

省时,能大量获取高纯度的标准品。

致谢

本论文是在我的导师刘石娟老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。

刘老师多次询问研究进程,并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。

她严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。

刘老师不仅在学业上给我以精心指导,同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向刘老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。

感谢在一起愉快的度过毕业论文小组的同学们,正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。

我还要感谢分子实验室，微生物实验室及生化实验室的师姐师哥们提供器材和药品以及他们的指导帮助。

最后要感谢的是我的父母,他们不仅培养了我对中国传统文化的浓厚的兴趣,让我在漫长的人生旅途中使心灵有了虔敬的归依，而且也为我能够顺利的完成毕业论文提供了巨大的支持与帮助.在未来的日子里，我会更加努力的学习和工作，不辜负父母对我的殷殷期望！

我一定会好好孝敬和报答他们！

最后再次对关心、帮助我的老师和同学表示衷心地感谢！

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