酵母细胞的破碎及破碎率的测定Word格式文档下载.docx

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1菌种纯化。

将酵母菌种转接至斜面培养基上，28～30℃，培养3～4d，培养成熟后，用接种环取一环酵母菌至8mL液体培养基中，28～30℃，培养24h。

2扩大培养。

将培养成熟的8mL液体培养基中的酵母菌全部转接至80mL液体培养基的锥形瓶中，28～30℃，培养15～20h。

（2）破碎前计数取1mL酵母细胞悬浮液经适当稀释后，用血细胞计数板在显微镜下计数。

3）细胞超声波破碎①将80mL酵母细胞悬浮液放入100mL容器中，液体浸没超声发射针1cm。

②打开开关，将频率设置中档，超声破碎1min，间歇1min，破碎20次。

3取1mL破碎后的细胞悬浮液经适当稀释后，滴一滴在血细胞计数板上，盖上盖玻片，用电子显微镜进行观察，计数。

计算细胞破碎率。

4破碎后的细胞悬浮液，于12000r/min、4℃离心30min，去除细胞碎片。

用Lowry法检测上清液蛋白质含量。

六、结果与讨论

1、用显微镜观察细胞破碎前后的形态变化。

2、用两种方法对细胞破碎率进行评价：

一种是直接计数法，对破碎后的样品进行适当的稀释后，通过在血球计数板上用显微镜观察来实现细胞的计数，从而计算出破碎率；

另一种是间接计数法，将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清液中的蛋白质含量，也可以评估细胞的破碎程度。

试验二细胞核与线粒体的分级分离

一、实验目的

1.了解离心分离的原理；

2.掌握差速离心法分离细胞器的方法及操作。

二、实验原理细胞内不同的结构，密度和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。

分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。

（1）匀浆（Homogenization）低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质（即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化钙）进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。

（2）分级分离（Fractionation）由低速到高速离心逐渐沉降。

先用低速使

较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。

由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。

（3）分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。

三、实验器材普通离心机，高速离心机，匀浆器，平皿，载玻片，显微镜。

小白鼠，0.9%NaCl溶液，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙，1%甲苯胺蓝，0.02%詹纳斯绿B染液。

（一）细胞核的分离提取操作步骤

1.用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块（去

除结缔组织）尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。

2.将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。

3.剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片I，做好标记，自然干燥。

4.将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500r/min离心15min；

缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；

同时涂一张上清液片Ⅱ做好标记，自然干燥；

余下的沉淀物进行下一步骤。

5.用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min，弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片Ⅲ，自然干燥。

6.将I、Ⅱ、Ⅲ涂片用l％甲苯胺蓝染色后盖片即可观察。

7.分别于高倍镜下观察三张图片，描述镜下所见。

（二）高速离心分离提取线粒体操作步骤

1.将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000r/min离心20min，弃上清，留取沉淀物。

2.加入0.25mol／L蔗糖-0．003mol／L氯化钙液lmL，用吸管吹打成悬液，以17000r/min离心20min，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1mL0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化钙溶液混匀成悬液（可用牙签）。

3.取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上（分别标记Ⅳ、Ⅴ涂片），各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20min。

4.油镜下观察，发现颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染液染成蓝绿色。

1、画出说分离的细胞核和线粒体的形态，并说明其结构特点。

2、解释差速离心的分离原理。

试验三胰凝乳蛋白酶的制备

1.掌握盐析法分离酶的基本原理和操作；

2.掌握结晶的基本方法和操作；

3.学习胰凝乳蛋白酶制备的方法。

蛋白质分子表面带有一定的电荷，因同种电荷相互排斥，使蛋白质分子彼此分离；

同时，蛋白质分子表面分布着各种亲水基团，这些基团与水分子相互作用形成水化膜，增加蛋白质水溶液的稳定性。

如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐，蛋白质分子表面的电荷被大量中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出，这种现象称为盐析。

由于不同的蛋白质分子表面所带的电荷多少不同，分布情况也不一样，因此不同的蛋白质盐析所需的盐浓度也各异。

盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步析出，达到粗分离蛋白质的目的。

高速组织捣碎机，解剖刀，镊子，剪刀，烧杯（50mL、100mL），离心机，离心管，漏斗，纱布，棉线，吸管（10mL、5mL、2mL、1mL、0.5mL），玻璃棒，滴管，透析袋，台秤，分析天平，离心机。

新鲜猪胰脏，0.125mol/LH2SO4溶液，固体（NH4）2SO4，1%酪蛋白溶液（称取酪蛋白1.0g，加pH为8.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液100mL，在沸水中煮5min使之溶解，冰箱中保存），磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH为7.4），0.1mol/LNaOH溶液，1%BaC2l。

整个操作过程在0～5℃条件下进行。

（1）提取取新鲜猪胰脏，放在盛有冰冷0.125mol/LH2SO4的容器中，保存在冰箱中待用。

去除胰脏表面的脂肪和结缔组织后称重。

用组织捣碎机绞碎，然后涽悬于2倍体积的冰冷0.125mol/LH2SO4溶液中，放冰箱内过夜。

将上述混悬液离心10min，上层液经2层纱布过滤至烧杯中，将沉淀再混悬于等体积的冰冷的0.125mol/LH2SO4溶液中，再离心，将两次上层液合并，即为提取液。

（2）分离取提取液10mL，加固体（NH4）2SO41.14g达0.2饱和度，放置10min，离心（3000r/min）10min。

弃去沉淀，保留上清液。

在上清液中加入固体（NH4）2SO41.323g达0.5饱和度，放置10min离心（3000r/min）10min。

弃去上清液，保留沉淀。

将沉淀溶解于3倍体积的水中，装入透析袋中，用pH为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液透析，直至1%BaC2l检查无白色BaSO4沉淀产生，然后离心（3000r/min）5min。

弃去沉淀（变性的酶蛋白），保留上清液。

在上清液中加（NH4）2SO4（0.39g/mL）达0.6饱和度，放置10min，离心（3000r/min）10min。

弃去上清液，保留沉淀（即为胰凝乳蛋白酶）。

（3）结晶取分离所得的胰凝乳蛋白酶容于3倍体积的水中。

然后加（NH4）2SO4（1.14g/mL）至胰凝乳蛋白酶溶液达0.25饱和度，用0.1mol/LNaOH调节至pH6.0，在室温（25～30℃）放置12h即可出现结晶。

1、在显微镜下观察胰凝乳蛋白酶的结晶形状。

2、计算胰凝乳蛋白酶的得率。

3、分析影响胰凝乳蛋白酶得率的因素。

试验四牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备

1.掌握盐析法和等电点沉淀法的原理和基本操作。

乳蛋白素（α-lactalbumin）广泛存在于乳品中，是乳糖合成所需要的重要蛋白质。

牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（casein），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出。

而乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。

利用这一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。

酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用从酪蛋白粗制剂中出去脂类杂质。

将去除掉酪蛋白的滤液的pH调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质可随澄清液除去。

再经过一次pH沉淀后，即可得到粗乳蛋白素。

烧杯（250mL、100mL、50mL），玻璃试管（10mm×

100mm），离心管（50mL），磁力搅拌器，pH计，离心机。

脱脂或低脂奶粉，无水硫酸钠，0.1mol/LHCl，0.1mol/LNaOH，0.05mol/L碳酸氢铵，滤纸，pH试纸，浓盐酸，0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH为4.6），乙醇。

（一）盐析法或等电点沉淀法制备酪蛋白

1.将50mL牛乳倒入250mL烧杯中，于40℃水浴中加热并搅拌。

2.在搅拌下缓慢加入10g无水硫酸钠（约10min内分次加入），之后再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下满满地加入50mL40左右的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，直到pH达到4.8左右，可以用酸度计调节。

将上述悬浮液冷却至室温，然后静置5min）。

3.将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。

将上述沉淀悬浮于30mL乙醇

中，倾于布式漏斗中，过滤出去乙醇溶液，抽干。

将沉淀从布式漏斗中已出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到酪蛋白。

准确秤量。

（二）等电点沉淀法制备酪蛋白素

1.将操作步骤

（一）所得的滤液置于100mL烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3.0±

0.1。

2.6000r/min离心15min，倒掉上清液。

3.在离心管内加入10mL去离子水，震荡，使馆内下层物重心悬浮，用0.1mol/LNaOH溶液调整pH至8.5～9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。

4.6000r/min离心10min，将上清液倒入50mL烧杯中。

5.将烧杯置于磁力搅拌器上，一边搅拌，一边利用pH计用0.1mol/LHCl调整pH至3.0±

6.6000r/min离心10min，倒掉上清液。

沉淀取出干燥，并秤量。

1、计算出每100mL牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5%）相比较。

求出实际得率。

2、计算出每100mL牛乳所制备出的乳蛋白素的数量。

3、讨论影响得率的因素。

试验五大蒜细胞SOD酶的提取和分离

、实验目的

1.掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作

2.掌握SOD酶提取分离的一般步骤。

、实验原理

超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可催化超氧负离子（O2-）进行岐化反应，生成氧和过氧化氢。

大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组

织和细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取出来。

由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。

同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。

研钵，石英砂，烧杯（50mL），玻璃棒，pH计，冷冻离心机，离心管。

新鲜蒜瓣，0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-无水乙醇3：

5），丙酮（用前预冷至-10℃）。

1.SOD酶的提取称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，加入0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.8）15mL，继续研磨20min，使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冷冻离心15min，弃沉淀，取上清液。

2.去除杂蛋白上清液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，6000r/min离心15min，弃去沉淀，得到的上清液即为粗酶液。

3.SOD酶的沉淀分离粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，

6000r/min离心15min，得到SOD酶沉淀。

冷冻干燥后即得成品。

对成品进行称量并测定酶活力。

1、计算出每500g大蒜蒜瓣所制备出的SOD酶的量。

2、讨论有机溶剂沉淀法与盐析法相比的优缺点。

试验六凝胶色谱法分离蛋白质

1.掌握凝胶色谱基本原理。

2.熟悉凝胶色谱法的操作。

3.了解物资在色谱柱中洗脱行为与分配系数哦的关系。

本实验将蓝葡聚糖200（分子质量2000kD）、细胞色素c（分子质量17kD）和DNFP甘-氨酸（分子质量0.5kD）的混合物通过交联葡聚糖凝胶G-50（SephadexG-50）的色谱柱以蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱。

蓝葡聚糖2000分子量最大，全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，而未进入凝胶颗粒内部，因而洗脱速度最快，最先流出柱，其Ve=Vo即Kd=0。

DNFP甘-氨酸分子量最小不被排阻而可完全进入凝胶颗粒内部，洗脱速度最慢，最后流出柱，其Ve=Vi+Vo即Kd=1。

细胞色素c分子量在上述二者之间，其洗脱速度居中。

可以直接从蓝、红、黄三种不同颜色直接观察到三种物质分离的情况，并通过洗脱体积可以计算Vi、Vo和各自的Kd。

玻璃色谱柱1cm×

25cm，蠕动泵，收集器。

四、试验试剂

交联葡聚糖凝胶G-50，蓝葡聚糖2000：

配成2mg/mL溶液，细胞色素c：

配成2mg/mL溶液。

DNFP甘-氨酸（二硝基氟苯-甘氨酸）：

称取甘氨酸0.15g溶于10%NaHC31O.5mL中，此液pH应在8.5～9.0左右，另取二硝基氟苯（DNFP）0.15g，溶于微热的95%乙醇3mL中，待其充分溶解后，立即倒入甘氨酸液管中。

将此管置于沸水浴煮沸5min（防止乙醇沸溢），待冷却后加2倍体积的95%乙醇，可见黄色DNFP甘-氨酸沉淀，离心2000r/min，1.5min弃去上清液，沉淀用95%乙醇洗两次，所得沉淀用蒸馏水1mL溶解即为DNFP甘-氨酸液，备用。

1.凝胶的准备称取交联葡聚糖G-50约4g，置于烧杯中，加蒸馏水适量平衡几次，倾去上浮的系小颗粒，于沸水浴中煮沸1h（此为加热法溶胀，如在室温溶胀，需放置3h），取出，倾去商城业中的细颗粒，待冷却至室温后进行装柱。

2.样品制备取配置好的蓝葡聚糖2000、细胞色素c和DNFP甘-氨酸各0.3mL，混合即可。

3.装柱将洗净的色谱柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0mL洗脱液。

一次性将凝胶从塑料接口加入色谱柱内，打开柱底部出口，接通蠕动泵，调节流速0.3mL/min。

凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到色谱柱底部，最后使凝胶床沉降达20cm高，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液体，以防色谱床内出现“纹路”。

在凝胶表面可盖一圆形滤纸，以免加入液体时冲起凝胶。

4.加样用滴管吸去凝胶床面上的溶液，使洗脱液恰好流到床表面，关闭出口，小心把样品（约0.5mL）沿壁加于柱内成一薄层。

切勿搅动床表面，打开出口使样品溶液渗入凝胶内并开始收集流出液，计量体积。

5.洗脱并收集样品流完后，分三次加入少量洗脱液洗下柱壁上样品，最后接通蠕动泵，调节流速为0.3mL/min，用部分收集器收集，每管1mL。

仔细观察样品在色谱柱内的分离现象。

用肉眼观察并以-、+符合记录三种物质洗脱液的颜色及深浅程度。

6.绘制洗脱曲线以洗脱体积为横坐标，洗脱液的颜色度（-、+、++、+++）为纵坐标（相应指示出洗脱液内物资浓度的变化），在坐标纸上作图，即得洗脱曲线。

1、分析洗脱曲线，讨论组分分离情况和试验注意点。

试验七离子交换色谱分离氨基酸

1.熟悉离子交换色谱技术的基本原理和方法。

2.熟悉离子交换色谱分离氨基酸的基本原理和操作。

氨基酸是两性电解质，有一定的等电点，在溶液pH小于其pI时带正电，大于其pI时带负电。

故在一定的pH条件小，各种氨基酸的带电情况不同，与离子交换剂上的交换基团的亲和力亦不同。

因而得到分离。

本实验选用Dowex50做为离子交换剂，它是含磺酸基团的强酸型阳离子交换剂，分离的样品为Asp、Gly、His三种氨基酸的混合液，这三种氨基酸分别属于酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸，它们在pH4.2的缓冲液中分别带负电荷和不同量的正电荷，与Dowex50的磺酸基团之间的亲和力不同，因此被洗脱下来的顺序亦不同，可以将三种不同的氨基酸分离开来，将各收集管分别用茚三酮显色鉴定。

分光光度计，色谱柱（0.8cm×

18cm），试管。

1）0.1mol/LNaOH。

2）氨基酸混合液Asp、Gly、His各10mg溶于30mL0.06mol/LpH4.2柠檬酸钠缓冲液中。

3）0.06mol/LpH4.2柠檬酸钠缓冲液取柠檬酸三钠98.0g溶于蒸馏水中，再加入42mL浓盐酸和6mL80%苯酚（现用可不加苯酚），最终加蒸馏水至5000mL，用pH计调溶液pH至4.2。

4）茚三酮显色液称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇溶解。

5）Dowex50的处理Dowex50用蒸馏水充分浸泡后，用6mol/LHCl浸泡煮沸1h，然后用蒸馏水洗去HCl至树脂呈中性，换15%NaOH浸泡1h，用蒸馏水洗去NaOH至树脂呈中性，最后用pH4.2柠檬酸钠缓冲液浸泡备用。

1）装柱前准备用流水冲洗色谱柱，然后用蒸馏水冲洗，柱流水口装上橡皮管放入2～3mL蒸馏水，按压橡皮管内气泡，抬高流出管防止蒸馏水排空。

2）装柱将处理好的Dowex50悬液小心倒入色谱柱内,待Dowex50自然下沉至柱下部时,打开下端放出液体,再慢慢加入悬液至Dowex50沉积面离色谱柱上缘约3cm时停止。

装柱时注意防止液面低于交换树脂平面以及气泡的产生。

3）平衡用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液反复加在柱床上面，平衡10min，最后接通蠕动泵，调节流速1mL/min。

4）加样柱内缓冲液的液面与树脂平面相平，但勿使树脂露出液面，马上用乳头滴管滴加7滴样品在树脂平面上（注意不能使树脂平面破坏），然后加少量缓冲液使样品进入柱内，反复两次，当样品完全进入树脂床后，接通蠕动泵，用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液洗脱，部分收集器收集。

5）收集与检测取12支试管编号，每管加入茚三酮显色液20滴，依次收集洗脱液每管2mL，混匀，置沸水浴15min取出，观色，用自来水冷却后在波长570nm处比色，当收集至第二洗脱峰出现时（茚三酮显色），即换用0.1mol/LN

aOH溶液洗脱直至第三洗脱峰出现后，停止洗脱。

6）树脂的再生用0.1mol/LNaOH溶液洗脱色谱柱10min。

7）回收树脂拔去橡皮接收管用洗耳球对着玻璃柱流出口将树脂吹入装树脂的小瓶内加入0.1mol/LNaOH浸泡。

8）洗脱曲线的绘制以吸光度为纵坐标，洗脱体积为横坐标绘制曲线。

1、分析洗脱曲线，讨论组分分离情况和试验注意事项。

试验八青霉素的萃取与萃取率的计算

1.学会利用溶剂萃取的方法对目的产物进行提纯。

2.掌握利用碘量法测定青霉素的含量，并计算出青霉素的萃取率。

二、实验原理萃取过程是利用混合物质在两个不相混溶的液相中各种组分的溶解度的不同，从而达到分离的目的。

pH为2.3时，青霉素在乙酸乙酯中比在水中溶解度大，因而可以将乙酸乙酯加到青霉素混合液中，并使其充分接触，从而使青霉素被萃取浓集到乙酸乙酯中，达到分离提存的目的。

三、实验器材分液漏斗，小烧杯，电子天平，酸式滴定管，移液管，容量瓶，量筒，玻璃棒，pH试纸。

四、试剂及药品

1）Na2S2O3（0.1mol/L）取Na2S2O3约2.6g与无水Na2CO30.02g，加新