抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性方法的建立Word格式.docx
《抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性方法的建立Word格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性方法的建立Word格式.docx(11页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
单抗ADCC生物学活性的转基因细胞检测方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检测方法。
【关键词】抗CD20单克隆抗体;
ADCC;
生物学活性;
荧光素酶检测系统
CD20抗原是分子量为35kD的非糖基化跨膜蛋白,CD20作为B细胞表面特有的分化抗原,在95%以上的B细胞淋巴瘤细胞膜上高密度表达,而在造血干细胞、血浆细胞和其它正常组织中不表达。
且CD20分子在与单克隆抗体结合后,无显著内化及脱落,是B淋巴细胞瘤免疫靶向治疗的理想靶点。
目前抗CD20单克隆抗体产品已显示良好的临床疗效并得到广泛应用。
大量研究表明,CD20单抗与B细胞淋巴瘤表面抗原结合后,主要通过补体依赖的细胞毒作用
(CDC)以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)将肿瘤细胞溶解。
ADCC
基金项目:
国家“重大新药创制”科技重大专项(编号2014ZX09304311-001、2012ZX09304010)通讯作者:
高凯,E-mail:
效应是CD20单抗杀伤肿瘤靶细胞重要机制之一。
CD20单抗与B细胞淋巴瘤细胞表面的CD20抗原结合后,导致抗体Fc段构象改变而并与细胞毒效应细胞表面上表达的FcRγIIIa结合,从而激发NK、巨噬细胞等效应细胞的杀伤活性,释放穿孔素和颗粒酶,对肿瘤靶细胞进行杀伤。
目前以CD20抗原为靶点的嵌合、人源化及其它各种突变体抗体药物质量研究中,其生物学活性主要采用的是CDC活性测定。
但在抗CD20单抗的另一作用机制ADCC生物学活性领域鲜有问津。
传统的ADCC测活方法多为基于新鲜制备的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)或者NK细胞作为效应细胞的杀伤试验,存在着变异大、操作繁琐、高背景值等缺陷,因此迫切需要研究建立评价ADCC生物学活性的新方法。
本文以荧光素酶报告基因检测系统为平台,利用改造后的Jurkat细胞系,在国内首次建立了灵敏、快速的ADCC生物学活性检测方法。
1.材料与方法
1.1细胞系
WIL2-S细胞系(购自ATCC);
Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa细胞系(购自Promega公司)。
该细胞系是稳定转染FcγRIIIa受体以及NFAT(nuclearfactorofactivatedT-cells)反应元件质粒的急性T细胞白血病细胞系细胞系,FcγRIIIa受体是介导ADCC生物学活性的必要分子,通过单抗的Fc段将效应细胞与靶细胞连接起来,激活NFAT通路,启动荧光素酶报告基因的表达。
1.2供试品
抗CD20单抗参比品和供试品为本室留样。
1.3主要试剂及仪器
胎牛血清(FBS)、无酚红RPMI1640培养基、MEM非必需氨基酸溶液(NEAA)及潮霉素B溶液为GIBCO公司产品;
牛血清白蛋白(BSA)、G418硫酸盐及Bio-GloTMLuciferaseAssaysystem为Promega公司产品;
M5多功能酶标仪及SoftMax分析软件为美国MolecularDevices公司产品;
PLA2.0平行线分析软件为Stegmann公司产品。
1.4ADCC剂量效应曲线的绘制
收集对数生长期的WIL2-S细胞及Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa细胞,1000rpm离心5min后以含0.5%BSA的无酚红RPMI1640培养基(稀释液)重悬细胞,调整细胞浓度分别至1×
106个/ml及6×
106个/ml,首先将靶细胞WIL2-S接种于白色不透明96孔细胞培养板中,25μl/孔;
以稀释液预稀释抗CD20单抗至18000ng/ml,再以稀释液进行1:
5倍稀释,共设9个稀释度,每一稀释度设2个复孔;
将稀释好的抗CD20单抗加入已接种WIL2-S细胞的培养板内,25μl/孔,再加入效应细胞Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa,25μl/孔;
以25μl稀释液代替抗CD20单抗作为阴性对照孔(Negative),75μl稀释液作为及背景孔(Background,BG);
置37℃,5%CO2条件下诱导6h后,室温条件下平衡至少15min;
加入荧光素酶底物溶液,75μl/孔,混合后在室温条件下反应5min,用M5酶标仪在细胞培养板上读取相对光单位(Relativelightunits,RLU)数值并按照以下公式计算诱导倍数(FoldofInduction,FI)。
FI=RLU(反应均值—背景均值)/RLU(阴性对照均值—背景均值);
利用SoftMax软件分析试验数据,以抗CD20单抗浓度对数为x轴,对应的FI值为y轴,选用四参数方程回归模型,拟合抗CD20单抗的剂量效应曲线。
1.5试验条件的优化
1.5.1靶细胞的选择
分别以表达CD20(+)的人B淋巴细胞WIL2-S、Raji及Daudi细胞作为靶细胞,按1.4项方法进行检测。
1.5.2抗体浓度范围的选择
设定抗CD20单抗的预稀释浓度为3000ng/ml,分别进行1:
3、1:
4的梯度稀释;
同时设定抗CD20单抗的预稀释浓度为18000ng/ml进行1:
5的梯度稀释,按1.4项方法进行检测。
1.5.3效靶比的选择固定效应细胞数量,以改变靶细胞数量的方式分别设定效靶比为3:
1、4:
1、
5:
1、6:
1、7.5:
1、10:
1、15:
1和30:
1,按1.4项方法进行检测。
1.5.4诱导时间的选择
分别设定诱导时间为3h、4h、5h、6h、7h及23h,按1.4项方法进行检测。
1.6方法学验证
1.6.1专属性试验
(1)靶细胞专属性:
以CD20(-)的C8166细胞及稀释液代替WIL2-S细胞进行检测。
(2)效应细胞专属性:
以未转染NFAT-luc-FcγRIIIa的Jurkat细胞及稀释液代替
Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa细胞进行检测。
(3)抗体专属性:
以抗HER-2单抗及稀释液代替抗CD20单抗进行检测。
1.6.2精密性试验
制备抗CD20单抗预稀释浓度分别为18000ng/ml的50%、75%、100%、125%及150%的样品,每个样品重复检查4次,根据各样品的半数有效浓度(EC50),以100%样品作为参比品,按照以下公式计算相对效价,计算相对效价的变异系数CV(%),验证该方法的精密性。
相对效价(%)=参比品EC50/样品EC50×
100%1.6.3准确性试验
制备抗CD20单抗预稀释浓度分别为18000ng/ml的50%、75%、100%、125%及150%的样品,每个样品重复检查4次,按下式计算回收率,验证该方法的准确性。
回收率(%)=相对效价测定值/相对效价理论值×
100%
2.结果
2.1抗CD20单抗的ADCC剂量效应曲线
利用SoftMax软件分析试验数据,以抗CD20单抗浓度对数为x轴,对应的诱导倍数值为y轴,选用四参数方程回归模型,拟合抗CD20单抗的剂量效应曲
线。
所得数据经SoftMax软件分析,符合四参数方程式:
y=(A-D)[/
1+(X/C)
B]+D,在半对数坐标纸上呈典型的S型曲线,R2>0.99,见图1。
EC50为7.32ng/ml
(式中C值)。
图1抗CD20单抗ADCC剂量效应曲线
Fig1.Dose-responsecurveofanti-CD20mAbADCC
2.2ADCC试验条件的优化
2.2.1靶细胞的选择
分别以表达CD20(+)的人B淋巴细胞WIL2-S、Raji及Daudi细胞作为靶细胞进行检测,结果见图2。
上述三种细胞作为表达CD20分子的人B淋巴细胞,均可作为抗CD20单抗介导ADCC生物学活性的靶细胞,WIL2-S细胞呈现更好的剂量效应曲线,最大诱导倍数达50.4,分别为Raji细胞和Daudi细胞的2.585倍和2.625倍。
图2三种CD20(+)靶细胞ADCC剂量效应曲线比较
Fig2.Comparedose-responsecurvefromthreegroupsofdifferentCD20(+)targetcell
2.2.2抗体浓度范围的选择
分别对抗CD20单抗进行1:
3倍、1:
4倍(预稀释浓度为3000ng/ml)及1:
5倍(预稀释浓度为18000ng/ml)的梯度稀释,共设9个稀释度,结果见图3。
基于保证剂量效应四参数曲线平台及保证诱导效果的考虑,在检测抗CD20单抗ADCC生物学活性时,最终选择起始稀释浓度为18000ng/ml,1:
5倍的稀释方案。
图3三种稀释方案ADCC剂量效应曲线比较
Fig2.Comparedose-responsecurvefromthreegroupsofdifferentdilutingdesign
2.2.3效靶比的选择
固定效应细胞调整靶细胞使之效靶比分别为3:
1、5:
1、15:
1,共8组。
结果见图4。
改变不同效靶比得到不同ADCC诱导倍数的结果,E:
T=6:
1时可以得到最大诱导倍数。
图4八种不同效靶比ADCC剂量效应曲线比较
Fig4.Comparedose-responsecurvefromeightgroupsofdifferentE:
T
2.2.4诱导时间的选择
改变加入靶细胞、抗CD20单抗及效应细胞后的诱导时间,共设立3h、4h、5h、6h、7h及23h共7组。
结果见图5。
改变不同诱导时间得到不同ADCC诱导倍数的结果,诱导时间为6-7h均可得到较大诱导倍数,考虑到工作效率等因素,选择诱导时间为6h。
图5七种不同诱导时间下ADCC剂量效应曲线比较
Fig5.Comparedose-responsecurvefromsevengroupsofdifferentinductiontime
2.3方法学验证
2.3.1专属性
设立6组对照,分别为:
靶细胞专属性:
a稀释液+抗CD20单抗+效应细胞;
bC8166细胞(CD20-)
+抗CD20单抗+效应细胞;
效应细胞专属性:
c靶细胞+抗CD20单抗+稀释液;
d靶细胞+抗CD20单抗
+Jurkat(NFAT-luc-;
FcγRIIIa-);
抗体专属性:
e靶细胞+稀释液+效应细胞;
f靶细胞+抗HER-2单抗+效应细胞;
结果见图6。
可见ADCC试验的成功依赖于专属的靶细胞、效应细胞及抗体。
图6抗CD20单抗ADCC生物学活性专属性试验检测结果
Fig6.Specificityresultsofanti-CD20mAbADCC
2.3.2.重现性
按1.4项方法分别进行8次独立检测,EC50平均值为11.43±
0.88ng/ml,变异系数CV为7.74%,绘制剂量效应曲线,见图7。
以第1次结果数据做参比,用PLA2.0软件对数据进行平行线分析,结果显示8条曲线的回归分析、线性及平行性均通过统计学检验,见表1。
图7抗CD20单抗ADCC生物学活性重现性试验检测结果
Fig7.Repeatabilityresultsofanti-CD20mAbADCC
表1抗CD20单抗ADCC生物学活性重现性试验PLA分析结果(n=8)Tab1.PLAanalysisresultsofanti-CD20mAbADCCrepeatability(n=8)
回归分析线性
平行性
PLA分析
F
P
统计学检验
1
/
参比
2
159.264
<0.05
0.000
>0.05
0.044
通过
3
128.517
0.420
4
157.504
0.498
5
161.637
0.001
6
164.958
0.384
7
152.325
8
159.732
0.381
2.3.3精密性
按照1.6.2项制备50%、75%、100%、125%及150%回收率样品,重复检测4次,结果见表2。
四组样品的相对效价(%)平均值分别为44.39±
3.93、72.74
±
2.78、128.28±
2.70。
变异系数CV(%)均小于10%。
表2抗CD20单抗ADCC生物学活性试验相对效价及回收率检测结果(n=4)Tab2.Potencyandrecoveryofanti-CD20mAbADCC(n=4)
相对效价(%)
样品
回收率(%)
50%样品
SD44.39±
3.93
CV(%)
8.85
SD88.78±
7.85
8.84
75%样品
125%样品
150%样品
72.74±
2.78
128.28±
7.01
168.19±
2.70
3.82
5.47
1.61
96.99±
3.70
102.63±
5.61
112.12±
1.80
3.81
2.3.4准确性
4组回收率样品的回收率分别为88.78±
5.61以及112.12±
1.80,见表2。
2.3.5.线性
分别以四组样品的相对效价理论值与实测值进行直线回归分析,相关系数为0.9905,两回归线的斜率b之间差异无统计学意义(t=0.033,p>
0.05),表明两者的剂量效应曲线相同。
3.讨论
近年来包括Rituximab在内众多重磅炸弹类药品的专利期即将结束,因此以CD20作为靶点的抗体生物类似药(Biosimilar)、人源化抗体、新型高亲和力抗体突变体等一直是国内外研发的热点。
目前我国也有超过10家单位专注于各类抗CD20单抗的研制。
因此如何确保众多抗CD20单抗药物的安全有效,是质量控制标准化研究面临的重要任务之一。
抗CD20单抗ADCC活性是其发挥生物学效应的重要因素,但目前尚无稳定而可靠的ADCC活性检测方法,因此大多抗CD20单抗的质量控制中未进行有效评价。
本文建立的抗CD20单抗ADCC生物学活性测定方法是利用经过基因工程改造的Jurkat细胞系,基于荧光素酶报告基因活性检测系统测定抗CD20单抗的ADCC生物学活性。
抗CD20抗体经倍比稀释后,可以得到较好的S型剂量效应曲线。
通过试验条件的优化,选择WIL2-S作为靶细胞,单抗预稀释浓度为18000ng/ml,按照1:
5倍进行梯度稀释;
效靶比选择在6:
1;
诱导时间选择6h。
方法学验证数据显示,ADCC的试验成功必须基于特异的CD20阳性靶细胞、特异性的单抗以及FcγRIIIa阳性效应细胞,由于EC50值不仅取决于单抗的亲和力还会受到效靶比、诱导时间、试验用缓冲液等条件影响,导致不同试验件EC50值的变异度较大,因此评价ADCC的方法利用相对效价更加合理可信,相对效数值越低,则说明单抗的ADCC生物学活性越大。
该方法操作简便易行,专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检查方法。
致谢感谢中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金(2012B6)对本研究工作的支持。
参考文献
1.Hogarth,P.M.andPietersz,G.A.(2012)Fcreceptor-targetedtherapiesforthetreatmentofinflammation,cancerandbeyond.NatureReviewsDrugDiscovery11,311–31.
2.Chung,S.etal.(2012)QuantitativeevaluationoffucosereducingeffectsinahumanizedantibodyonFcγreceptorbindingandantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicityactivities.mAbs4,1–15.
3.Parekh,B.S.etal.(2012)Developmentandvalidationofanantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity-reportergeneassay.mAbs4,1–9.
4.Surowy,T.etal.(2012)LowvariabilityADCCbioassay.GEN32(7).
5.Cheng,Z.J.etal.(2012)Developmentofabioluminescentcell-basedbioassaytomeasureFcreceptorfunctionalityinantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity.AmericanAssociationofCancerResearch(AACR)AnnualMeeting,poster#2840.