ISO 215282食品微生物学肠杆菌科检测和计数的水平方法第2部分菌落计数法Word文档下载推荐.docx

ISO 215282食品微生物学肠杆菌科检测和计数的水平方法第2部分菌落计数法Word文档下载推荐.docx

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4.4.计算

通过每块平板上确证的典型菌落的数量来计算每ml/g检样中肠杆菌科的数量。

5.稀释液，培养基和试剂

相关实验室材料，见ISO7218

培养基和试剂的组分以及它们制备的描述见附录A。

培养基的性能测试，见ISO11133和附录A。

6.设备和耗材

一次性设备如果有合适的规格，可用来替代反复使用的玻璃器皿。

6.1.干热灭菌设备（烘箱）或湿热灭菌设备（高压釜），依据ISO7218的规定。

6.2.培养箱，37℃±

1℃（或30℃±

1℃）

6.3.干燥柜（对流通风）或培养箱，25℃-50℃。

6.4.水浴或相似设备，47℃-50℃。

6.5.试管或烧瓶，适当容量。

6.6.平皿，玻璃或塑料材质，直径约90mm和（可选）大尺寸（直径约140mm）。

6.7.接种环（直径约3mm）或接种针，铂/铱，镍/铬，和/或玻璃棒，或等效的一次性无菌接种环或接种针。

6.8.刻度吸管或自动吸管，标称容量为10ml，1ml和0.1ml。

6.9.pH计，25℃时精确到±

0.1pH。

6.10.均质器，按ISO7218的规定。

7.采样

采样不是本文件中规定的一部分方法。

参见相关产品具体的国际标准。

如果没有相关产品采样的具体国际标准，建议相关各方就此问题达成协议。

建议的采样技术如下：

——ISO/TS17728用于食品和动物饲料；

——ISO13307用于初步加工阶段；

——ISO17604用于动物胴体；

——ISO18593用于环境样品。

重要的是，实验室收到的样品要有代表性并且在运输和储存中不应受到破坏或改变。

8.检样的制备

依据相关产品具体的国际标准制备检样。

如果没有可用的具体国际标准，建议相关各方就此问题达成协议。

9.过程

9.1.常规

见ISO7218。

9.2.检样，初始悬浮液和稀释液见ISO6887（全部）

如果是液体产品用检样，如果是其它产品用初始悬浮液制备一系列十倍系列稀释液。

9.3.接种和培养

9.3.1.取一块无菌平板（6.6），用一支无菌移液管（6.8），如果是液体产品转移1ml检样到平板中，如果是其它产品转移1ml初始悬浮液到平板中。

如有需要，用进一步稀释液重复描述的步骤，每个稀释液用1支无菌的吸管。

如果不使用初始悬浮液，该稀释度要接种2块平板（ISO7218）。

9.3.2.将制备好的已在水浴（6.4）中冷却至47℃-50℃的结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBA）琼脂（A.2）倾倒入平板，每块约15ml。

从接种至平板到倾倒琼脂之间不要超过15min。

水平移动小心将培养基混匀，将平板放在冷的平面上，待凝固。

9.3.3.混合物完全凝固后，再用5ml至10ml结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBA）琼脂覆盖一层，按9.3.2中的描述冷却，以防止蔓延生长和达到半厌氧条件。

按上述描述凝固。

9.3.4.翻转制备好的平板，在37℃（6.2）培养24h±

2h。

9.4.计数并选择菌落进行鉴定

典型菌落是粉色至红色或紫色的（有或没有沉淀环）。

选择含有小于150个典型菌落的平板，计数这些菌落。

随机选择5个这样的菌落进行传代培养（见9.5），用作生化鉴定试验（见9.6）。

如果平板上小于5个菌落，挑取所有出现的可疑菌落。

蔓延菌落应该被认定是一个单独的菌落，如果蔓延生长不到平板的四分之一，计数未受影响部分的平板并推定计算整块平板上的理论的菌落数。

如果蔓延生长超过平板的四分之一，抛弃不用计数。

部分肠杆菌科会导致菌落或培养基脱色，因此当无典型菌落存在时，选择5个白色菌落进行鉴定。

9.5.传代培养选定的菌落

将选定的菌落划线在预先干燥的非选择性琼脂培养基（A.3）表面，这是一个可以得到良好分离的菌落的方式。

翻转平板37℃培养24h±

从每块接种的平板上选择一个分离良好的菌落，进行生化鉴定试验（见9.6）。

9.6.生化鉴定试验

9.6.1.氧化酶试验

用铂/铱环，丝或玻璃棒（6.7），取一部分分离良好的菌落（见9.5），并划线在浸有氧化酶试剂（A.5）的滤纸上，或商品化的纸片或棒上。

不应使用镍/铬环或丝。

10s内滤纸的颜色没有变成深蓝紫色的认定试验为阴性。

即用型的纸片或棒，参见制造商的说明。

9.6.2.发酵试验

用金属丝（6.7），挑取相同的在9.5中氧化酶试验阴性的菌落，穿刺于含葡萄糖OF培养基（A.4）的试管中。

表面覆盖至少1cm厚的无菌矿物油（A.6）。

试管在37℃培养24h±

如果试管内整理变黄，认为反应为阳性的。

9.6.3.生化试验的解释

氧化酶阴性且葡萄糖阳性的菌落被认定为是肠杆菌科。

10.结果表述

计算并报告每g/ml，每平方厘米，或每采样装置的肠杆菌科数量。

11.该方法的性能特点

11.1.实验室间研究

该方法精确度测定的实验室间研究的结果，汇总在附录B中。

重复性和重现性限值的测定，使用了不同污染程度的五种食品。

从实验室间研究得出的数值，可能不适用于附录B中以外的浓度范围和食物种类。

注在本文中，“种类”与“食物”相结合是为了提高本文的可读性，然而，“食物”也可换成“饲料”和本文中提到的其它领域的食物。

11.2.重复性限

两个绝对独立的单元（转换为log10）试验结果（每g/ml的数量），或者用相同方法，用相同试验材料，在同一实验室由同一个操作员用相同的设备在最短时间间隔内，得出的正常范围的两个较高和较低的结果的比值，不应有大于5%的情况超过重复性限r。

作为重复性限的一般示值（r），下列结果来自实验室间研究的所有水平每个矩阵试验的方差估计值（见附件B）当检验样品时可以使用。

r=0.37（表示试验机国转换为log10后的差值）；

或

r=2.33（表示为试验结果之间的比值）。

例在一个约定的实验室中，每克样品材料的实验结果为10000或1.0×

104或log104.0cfu。

在重复性条件下，与转换成log10的结果相差不应大于±

0.37log10单位。

所以相同样品第二次的实验结果的范围应在3.63（4.0-0.37）和4.37（4.0+0.37）log10单位之间。

11.3.再现性限

两个绝对独立的单元（转换为log10）试验结果（每g/mlcfu数量）或者用相同方法相同试验材料，在不同实验室由不同操作员用不同设备得出的正常范围的两个较高和较低的结果的比值，不应有大于5%的情况超过再现性限值R。

作为再现性限（R）的一般示值，下列结果来自实验室间研究的所有水平每个矩阵实验室的方差估计值（见附件B），当检验食品样品时可使用。

R=0.87（表示试验结果转换为log10后的差值）；

r=7.38（表示为试验结果之间的比值）。

例1在一个约定的实验室中，每g样品材料的试验结果为10000或1.0×

104或log104.0cfu。

在再现性条件下，与转换成log10的结果相差不应大于±

0.87log10单位。

所以相同样品第二次的试验结果的范围应在3.13（4.0-0.87）和4.87（4.0+0.87）log10单位之间。

10

对不转换成log的结果，第一实验室和第二实验室的试验结果之间比值不应大于7.38.所以第二实验室得出的结果应该在1360（=10000/7.38）和73800（1000×

7.38）cfu/g之间。

例2实验室想要知道一个符合预先设定限值（如，限值为1000或log3）的样品的最大值。

为此，R值（以对数规则）必须乘以系数0.59。

系数0.59反应的事实是，一个单边95%区间的试验用来测验是否超出了极限，可以从

下列公式得出：

0.59=

1.64

1010

最大值0.51（0.87×

0.59），是试验结果转换成log10后的差值，或3.26（100.51）是试验结果之间的比值。

所以结果高于log103.51（log3+log0.51）或3260（1000×

3.26）不能表示不符合极限。

12.试验报告

试验报告应包含：

——使用的试验方法，引用本文件，即ISO21528-2；

——使用的采样方法，如已知；

——本文档中没有规定的所有操作条件，或选做项目，以及可能对结果产生影响的任何事件；

——任何偏差（例如：

所用的培养基或培养条件）；

——用于完整鉴定样品的所有信息；

——得到的实验结果。

13.质量保证

实验室拥有明确的质量控制体系，以确保设备，试剂和技术适用于试验。

阳性对照，阴性对照及空白作为试验的一部分。

培养基的性能测试规定见附录A，描述见ISO11133。

附录A

（规范）培养基和试剂

A.1.稀释液

按照ISO6887-1和ISO18593的规定。

A.2.结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBG）琼脂

A.2.1.组分

动物组织酶解物7.0g

酵母提取物3.0g

胆盐1.5g

葡萄糖10.0g

氯化钠5.0g

中性红0.03g

结晶紫0.002g

琼脂9g-18ga

水1000ml

a依据琼脂的凝胶强度。

A.2.2.制备

将组分或完全脱水培养基溶解在水中并煮沸。

如有需要，调整pH值，使煮沸后在25℃时为7.4±

0.2。

将培养基分装到适当容积的试管或烧杯（6.5）中。

不要对培养基灭菌。

使用前再制备培养基，制备好的培养基在4h内使用。

A.2.3.培养基质量保证的性能测试

有关选择性和生产率的定义，依据ISO11133。

表A.1显示了结晶紫中性红胆盐葡萄糖

（VRBG）琼脂的性能指标。

表A.1——结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBG）琼脂性能指标

培养基

微生物

指标

培养

条件

质控

菌株a

WDCMa

编号

参比培

养基

方法

标准g

特征

反应

大肠埃

00012b

希氏菌

00013

VRBG

（固体培养基）

肠杆菌科

生长率

（24±

2）h（/37

±

1）℃

鼠伤寒

沙门氏菌c，d

00031

TSAe

定量

Pf≥0.5R

粉色至红色菌落有或没有沉淀环

肠炎沙

门氏菌

00030

c，d

选择性

粪肠球菌d

00009

00087

定性

全部抑制（0）

a菌株名录参考www.wfcc.info。

以了解菌株编号和联系方式等信息；

WDCM：

世界微生物数据中心

b实验室用菌株（最低限度）

c一些国家限制和指明可能要求使用不同的血清型。

参考国家关于沙门氏血清型玄色的规定。

d自由选择菌种至少选择其中一种菌种。

eTSA=胰蛋白胨大豆琼脂fPR=生长率

g生长/混浊分类，0：

无生长/无混浊；

1：

弱生长/微混浊；

2：

生长/非常混浊。

A.3.非选择性琼脂培养基

A.3.1.常规

非选择性琼脂培养基的选择由检测的实验室自行选择。

相关的制备应遵循制造商的说明。

非选择性培养基的一个例子是营养琼脂（NA）。

A.3.2.营养琼脂的组分

肉类提取物3.0g

动物组织酶解物5.0g

A.3.3.制备

将组分或完全脱水培养基溶于水中并加热，不断搅拌。

如有需要，调节pH值，使灭菌后在25℃时为7.0±

将培养基转移到适当容量的无菌试管或烧瓶（6.5）中。

高压釜中121℃灭菌15min。

A.3.4.琼脂平板制备

在水浴（6.4）中冷却培养基至47℃-50℃，混匀并倾倒至无菌平板（6.6）中。

待凝固。

使用前，在烘箱（6.3）中小心干燥琼脂平板（取下盖子，琼脂面向下），并设置在25℃

-50℃之间直到琼脂表面干燥。

倾倒好的平板，避免干燥，5℃±

3℃下存放不超过4周。

A.3.5.培养基质量保证的性能测试

选择性和生长率的定义，参见ISO11133。

表A.2给出了营养琼脂的性能指标。

表A.2——营养琼脂的性能指标

WDCMa编

号

营养琼脂

（24±

2）h/（37±

1）℃

大肠埃希氏菌

良好生长

（2）

c生长/混浊分类，0：

A.4.葡萄糖OF培养基

A.4.1.组分

酪蛋白酶解物2.0g

K2HPO40.3g

NaCl5.0g

溴百里酚蓝0.08g

琼脂3g-4ga

a取决于琼脂的凝胶强度。

A.4.2.制备

将组分或完全脱水培养基完全溶于水中，如有必要可加热。

如有必要，调整pH，使灭菌后的pH在25℃为6.8±

分装培养基到适当容量（如：

10ml培养基加入16mm×

160mm试管中）的试管（6.5）

中。

在高压釜（6.1）中121℃灭菌15min。

培养基可在5℃±

3℃存放不超过4周。

使用前，在沸水中或蒸汽中加热15min，排出氧气，然后快速冷却至培养温度。

A.4.3.用于质量保证的性能测试

葡萄糖OF培养基的性能在使用前应被证实（ISO11133）。

例如：

适宜的质控菌株是大肠埃希氏菌WDCM00012（阳性质控）和铜绿假单胞菌

WDCM00025（阴性质控，仅在试管顶部有黄色）。

A.5.氧化酶试剂

A.5.1.组分

盐酸四甲基对苯二胺1.0g

水100ml

A.5.2.制备

组分溶于冷水中。

使用前立刻制备。

可以使用商品化的纸片或棒。

这种情况，要按照生产商的建议使用。

A.5.3.质量保证的性能测试

氧化酶试剂的性能在使用前应该被证实（ISO11133）

适宜的质控菌株是铜绿假单胞菌WDCM00025（阳性对照），大肠埃希氏菌WDCM

00012（阴性对照）。

A.6.无菌矿物油

矿物油可在160℃的干热烘箱中灭菌1h-2h。

附录B

（信息）

方法验证研究和性能特点

一项涉及了8个国家13个实验室的国际实验室间研究，涉及了蛋制品和生肉（都受到自然污染），还有饲料，牛奶和提拉米苏（这三种都受到了人为污染）。

每种被检测的食品样品都受到了3中不同程度的污染。

研究在2013年有位于荷兰瓦赫宁根/乌得勒支的荷兰食品与消费品安全管理局（NVWA）组织。

提交给实验室间进行研究的方法是ISO21528-2，包括在结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBG）琼脂上形成特征菌落且发酵葡萄糖、氧化酶反应呈阴性的菌落计数。

下列参数是依据ISO5725-2:

1994计算并在表B.1至B.5[1]中给出精确度数据。

一些实验室数据因明确的计数原因（与协议偏差）被排除在计算外。

表B.1——鸡蛋制品的数据分析结果

参数

污染水平（log10cfu/g）

低（3.5）

中（4.2）

高（5.8）

参与合作实验室数量

13

对数据评估后保留的合作实验室数量

12

11

样品总数（每个实验室2个水平）

26

对数据评估后保留的样品数量

24

22

平均数Σa（log10cfu/g）

3.48

4.21

5.78

重复性标准偏差Sr（log10cfu/g）

0.12

0.25

重复性限r

——log10差别的程度（log10cfu/g）

0.32

0.33

0.70

——正常比值的程度（cfu/g）

2.10

2.14

5.03

再现性标准偏差SR（log10cfu/g）

0.50

0.48

再现性限R

0.91

1.39

1.33

8.12

24.66

21.48

表B.2——生肉制品的数据分析结果

低（2.4）

中（3.7）

高（3.8）

2.43

3.72

3.75

0.15

0.13

0.10

0.42

0.36

0.27

2.65

2.28

1.86

0.28

0.57

0.79

1.02

1.61

6.10

10.38

40.7

表B.3——饲料的数据分析结果

低（1.5）

中（2.5）

高（3.5）

20

1.60

2.50

3.53

0.08

0.34

0.23

0.24

2.19

1.68

1.72

0.18

0.17

0.20

0.46

0.56

3.14

2.90

3.65

表B.4——巴氏灭菌乳的数据分析结果

1.53

2.40

3.46

0.14

0.11

0.40

0.30

2.00

0.19

0.67

0.49

0.54

4.66

3.10

3.45

表B.5——提拉米苏的数据分析结果

参与合作