ISO 215282食品微生物学肠杆菌科检测和计数的水平方法第2部分菌落计数法Word文档下载推荐.docx

1、4.4.计算通过每块平板上确证的典型菌落的数量来计算每 ml/g 检样中肠杆菌科的数量。5.稀释液，培养基和试剂相关实验室材料，见 ISO 7218培养基和试剂的组分以及它们制备的描述见附录 A。培养基的性能测试，见 ISO 11133 和附录 A。6.设备和耗材一次性设备如果有合适的规格，可用来替代反复使用的玻璃器皿。6.1.干热灭菌设备（烘箱）或湿热灭菌设备（高压釜），依据 ISO 7218 的规定。6.2. 培养箱，371（或 301）6.3.干燥柜（对流通风）或培养箱，25-50。6.4.水浴或相似设备，47-50。6.5.试管或烧瓶，适当容量。6.6.平皿，玻璃或塑料材质，直径约 9

2、0mm 和（可选）大尺寸（直径约 140mm）。6.7.接种环（直径约 3mm）或接种针，铂/铱，镍/铬，和/或玻璃棒，或等效的一次性无菌接种环或接种针。6.8.刻度吸管或自动吸管，标称容量为 10ml，1ml 和 0.1ml。6.9.pH 计，25时精确到0.1pH。6.10.均质器，按 ISO 7218 的规定。7.采样采样不是本文件中规定的一部分方法。参见相关产品具体的国际标准。如果没有相关产品采样的具体国际标准，建议相关各方就此问题达成协议。建议的采样技术如下：ISO/TS 17728 用于食品和动物饲料；ISO 13307 用于初步加工阶段；ISO 17604 用于动物胴体；ISO

3、18593 用于环境样品。重要的是，实验室收到的样品要有代表性并且在运输和储存中不应受到破坏或改变。8.检样的制备依据相关产品具体的国际标准制备检样。如果没有可用的具体国际标准，建议相关各方就此问题达成协议。9.过程9.1.常规见 ISO 7218。9.2.检样，初始悬浮液和稀释液见 ISO 6887（全部）如果是液体产品用检样，如果是其它产品用初始悬浮液制备一系列十倍系列稀释液。9.3.接种和培养9.3.1.取一块无菌平板（6.6），用一支无菌移液管（6.8），如果是液体产品转移 1ml 检样到平板中，如果是其它产品转移 1ml 初始悬浮液到平板中。如有需要，用进一步稀释液重复描述的步骤，每

4、个稀释液用 1 支无菌的吸管。如果不使用初始悬浮液，该稀释度要接种 2 块平板（ISO 7218）。9.3.2.将制备好的已在水浴（6.4）中冷却至 47-50的结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBA） 琼脂（A.2）倾倒入平板，每块约 15ml。从接种至平板到倾倒琼脂之间不要超过 15min。水平移动小心将培养基混匀，将平板放在冷的平面上，待凝固。9.3.3.混合物完全凝固后，再用 5ml 至 10ml 结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBA）琼脂覆盖一层，按 9.3.2 中的描述冷却，以防止蔓延生长和达到半厌氧条件。按上述描述凝固。9.3.4.翻转制备好的平板，在 37（6.2）培养 24h2h。9.

5、4.计数并选择菌落进行鉴定典型菌落是粉色至红色或紫色的（有或没有沉淀环）。选择含有小于 150 个典型菌落的平板，计数这些菌落。随机选择 5 个这样的菌落进行传代培养（见 9.5），用作生化鉴定试验（见 9.6）。如果平板上小于 5 个菌落，挑取所有出现的可疑菌落。蔓延菌落应该被认定是一个单独的菌落，如果蔓延生长不到平板的四分之一，计数未受 影响部分的平板并推定计算整块平板上的理论的菌落数。如果蔓延生长超过平板的四分之一， 抛弃不用计数。部分肠杆菌科会导致菌落或培养基脱色，因此当无典型菌落存在时，选择 5 个白色菌落进行鉴定。9.5.传代培养选定的菌落将选定的菌落划线在预先干燥的非选择性琼脂培

6、养基（A.3）表面，这是一个可以得到良好分离的菌落的方式。翻转平板 37培养 24h从每块接种的平板上选择一个分离良好的菌落，进行生化鉴定试验（见 9.6）。9.6.生化鉴定试验9.6.1.氧化酶试验用铂/铱环，丝或玻璃棒（6.7），取一部分分离良好的菌落（见 9.5），并划线在浸有氧化酶试剂（A.5）的滤纸上，或商品化的纸片或棒上。不应使用镍/铬环或丝。10s 内滤纸的颜色没有变成深蓝紫色的认定试验为阴性。即用型的纸片或棒，参见制造商的说明。9.6.2.发酵试验用金属丝（6.7），挑取相同的在 9.5 中氧化酶试验阴性的菌落，穿刺于含葡萄糖 OF 培养基（A.4）的试管中。表面覆盖至少 1c

7、m 厚的无菌矿物油（A.6）。试管在 37培养 24h如果试管内整理变黄，认为反应为阳性的。9.6.3.生化试验的解释氧化酶阴性且葡萄糖阳性的菌落被认定为是肠杆菌科。10.结果表述计算并报告每 g/ml，每平方厘米，或每采样装置的肠杆菌科数量。11.该方法的性能特点11.1.实验室间研究该方法精确度测定的实验室间研究的结果，汇总在附录 B 中。重复性和重现性限值的测定，使用了不同污染程度的五种食品。从实验室间研究得出的数值，可能不适用于附录 B 中以外的浓度范围和食物种类。注 在本文中，“种类”与“食物”相结合是为了提高本文的可读性，然而，“食物”也可换成“饲料”和本文中提到的其它领域的食物。

8、11.2.重复性限两个绝对独立的单元（转换为 log10）试验结果（每 g/ml 的数量），或者用相同方法，用相同试验材料，在同一实验室由同一个操作员用相同的设备在最短时间间隔内，得出的正常范围的两个较高和较低的结果的比值，不应有大于 5%的情况超过重复性限 r。作为重复性限的一般示值（r），下列结果来自实验室间研究的所有水平每个矩阵试验的方差估计值（见附件 B）当检验样品时可以使用。r=0.37（表示试验机国转换为 log10 后的差值）；或r=2.33（表示为试验结果之间的比值）。例 在一个约定的实验室中，每克样品材料的实验结果为 10000 或 1.0104 或 log104.0 cfu

9、。在重复性条件下，与转换成 log10 的结果相差不应大于0.37log10 单位。所以相同样品第二次的实验结果的范围应在 3.63（4.0-0.37）和 4.37（4.0+0.37）log10 单位之间。11.3.再现性限两个绝对独立的单元（转换为 log10）试验结果（每 g/ml cfu 数量）或者用相同方法相同试验材料，在不同实验室由不同操作员用不同设备得出的正常范围的两个较高和较低的结果的比值，不应有大于 5%的情况超过再现性限值 R。作为再现性限（R）的一般示值，下列结果来自实验室间研究的所有水平每个矩阵实验室的方差估计值（见附件 B），当检验食品样品时可使用。R=0.87（表示试

10、验结果转换为 log10 后的差值）；r=7.38（表示为试验结果之间的比值）。例1 在一个约定的实验室中，每g 样品材料的试验结果为10000 或1.0104 或log104.0 cfu。在再现性条件下，与转换成 log10 的结果相差不应大于0.87 log10 单位。所以相同样品第二次的试验结果的范围应在 3.13（4.0-0.87）和 4.87（4.0+0.87）log10 单位之间。10对不转换成 log 的结果，第一实验室和第二实验室的试验结果之间比值不应大于 7.38. 所以第二实验室得出的结果应该在 1360（=10000/7.38）和 73800（10007.38）cfu/g

11、 之间。例 2 实验室想要知道一个符合预先设定限值（如，限值为 1000 或 log 3）的样品的最大值。为此，R 值（以对数规则）必须乘以系数 0.59。系数 0.59 反应的事实是，一个单边 95%区间的试验用来测验是否超出了极限，可以从下列公式得出：0.59=1.6410 10最大值 0.51（0.870.59），是试验结果转换成 log10 后的差值，或 3.26（100.51）是试验结果之间的比值。所以结果高于 log103.51（log 3+log 0.51）或 3260（10003.26）不能表示不符合极限。12.试验报告试验报告应包含：使用的试验方法，引用本文件，即 ISO 2

12、1528-2；使用的采样方法，如已知；本文档中没有规定的所有操作条件，或选做项目，以及可能对结果产生影响的任何事件；任何偏差（例如：所用的培养基或培养条件）；用于完整鉴定样品的所有信息；得到的实验结果。13.质量保证实验室拥有明确的质量控制体系，以确保设备，试剂和技术适用于试验。阳性对照，阴性对照及空白作为试验的一部分。培养基的性能测试规定见附录 A，描述见 ISO 11133。附录 A（规范） 培养基和试剂A.1.稀释液按照 ISO 6887-1 和 ISO 18593 的规定。A.2.结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBG）琼脂A.2.1.组分动物组织酶解物 7.0g酵母提取物 3.0g胆盐 1

13、.5g葡萄糖 10.0g氯化钠 5.0g中性红 0.03g结晶紫 0.002g琼脂 9g-18ga水 1000mla 依据琼脂的凝胶强度。A.2.2.制备将组分或完全脱水培养基溶解在水中并煮沸。如有需要，调整 pH 值，使煮沸后 在 25时为 7.40.2。将培养基分装到适当容积的试管或烧杯（6.5）中。不要对培养基灭菌。使用前再制备培养基，制备好的培养基在 4h 内使用。A.2.3.培养基质量保证的性能测试有关选择性和生产率的定义，依据 ISO 11133。表 A.1 显示了结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBG）琼脂的性能指标。表 A.1结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBG）琼脂性能指标培养基微生物

14、指标培养条件质控菌株 aWDCMa编号参比培养基方法标准 g特征反应大肠埃 00012b希氏菌00013VRBG（固体培养基）肠杆菌科生长率（ 24 2）h（/ 371）鼠伤寒 沙门氏菌 c，d00031TSAe定量P f0.5 R粉色至红色菌落有或没有沉淀环肠炎沙 门氏菌 00030c，d选择性粪肠球菌 d0000900087定性全部抑制（0）a菌株名录参考 www.wfcc.info。以了解菌株编号和联系方式等信息；WDCM：世界微生物数据中心b实验室用菌株（最低限度）c一些国家限制和指明可能要求使用不同的血清型。参考国家关于沙门氏血清型玄色的规定。d自由选择菌种至少选择其中一种菌种。eT

15、SA=胰蛋白胨大豆琼脂f PR=生长率g 生长/混浊 分类，0：无生长/无混浊；1：弱生长/微混浊；2：生长/非常混浊。A.3.非选择性琼脂培养基A.3.1.常规非选择性琼脂培养基的选择由检测的实验室自行选择。相关的制备应遵循制造商的说明。非选择性培养基的一个例子是营养琼脂（NA）。A.3.2.营养琼脂的组分肉类提取物 3.0g动物组织酶解物 5.0gA.3.3.制备将组分或完全脱水培养基溶于水中并加热，不断搅拌。如有需要，调节 pH 值，使灭菌后在 25时为 7.0将培养基转移到适当容量的无菌试管或烧瓶（6.5）中。高压釜中 121灭菌 15min。A.3.4.琼脂平板制备在水浴（6.4）中

16、冷却培养基至 47-50，混匀并倾倒至无菌平板（6.6）中。待凝固。使用前，在烘箱（6.3）中小心干燥琼脂平板（取下盖子，琼脂面向下），并设置在 25-50之间直到琼脂表面干燥。倾倒好的平板，避免干燥，53下存放不超过 4 周。A.3.5.培养基质量保证的性能测试选择性和生长率的定义，参见 ISO 11133。表 A.2 给出了营养琼脂的性能指标。表 A.2 营养琼脂的性能指标WDCMa 编号营养琼脂（242） h/ （ 37 1）大肠埃希氏菌良好生长（2）c生长/混浊 分类，0：A.4.葡萄糖 OF 培养基A.4.1.组分酪蛋白酶解物 2.0gK2HPO4 0.3gNaCl 5.0g溴百里酚

17、蓝 0.08g琼脂 3g-4gaa 取决于琼脂的凝胶强度。A.4.2.制备将组分或完全脱水培养基完全溶于水中，如有必要可加热。如有必要，调整 pH，使灭菌后的 pH 在 25为 6.8分装培养基到适当容量（如：10ml 培养基加入 16mm160mm 试管中）的试管（6.5）中。在高压釜（6.1）中 121灭菌 15min。培养基可在 53存放不超过 4 周。使用前，在沸水中或蒸汽中加热 15min，排出氧气，然后快速冷却至培养温度。A.4.3.用于质量保证的性能测试葡萄糖 OF 培养基的性能在使用前应被证实（ISO 11133）。例如：适宜的质控菌株是大肠埃希氏菌 WDCM00012（阳性质

18、控）和铜绿假单胞菌WDCM00025（阴性质控，仅在试管顶部有黄色）。A.5.氧化酶试剂A.5.1.组分盐酸四甲基对苯二胺 1.0g水 100mlA.5.2.制备组分溶于冷水中。使用前立刻制备。可以使用商品化的纸片或棒。这种情况，要按照生产商的建议使用。A.5.3.质量保证的性能测试氧化酶试剂的性能在使用前应该被证实（ISO 11133）适宜的质控菌株是铜绿假单胞菌 WDCM 00025（阳性对照），大肠埃希氏菌 WDCM00012（阴性对照）。A.6. 无菌矿物油矿物油可在 160的干热烘箱中灭菌 1h-2h。附录 B（信息）方法验证研究和性能特点一项涉及了 8 个国家 13 个实验室的国际

19、实验室间研究，涉及了蛋制品和生肉（都受到自然污染），还有饲料，牛奶和提拉米苏（这三种都受到了人为污染）。每种被检测的食品样品都受到了 3 中不同程度的污染。研究在 2013 年有位于荷兰瓦赫宁根/乌得勒支的荷兰食品与消费品安全管理局（NVWA）组织。提交给实验室间进行研究的方法是 ISO 21528-2，包括在结晶紫中性红胆盐葡萄糖（VRBG）琼脂上形成特征菌落且发酵葡萄糖、氧化酶反应呈阴性的菌落计数。下列参数是依据 ISO 5725-2:1994 计算并在表 B.1 至 B.51中给出精确度数据。一些实验室数据因明确的计数原因（与协议偏差）被排除在计算外。表 B.1鸡蛋制品的数据分析结果参

20、数污染水平（log10 cfu/g）低（3.5）中（4.2）高（5.8）参与合作实验室数量13对数据评估后保留的合作实验室数量1211样品总数（每个实验室 2 个水平）26对数据评估后保留的样品数量2422平均数a（log10 cfu/g）3.484.215.78重复性标准偏差 Sr（log10 cfu/g）0.120.25重复性限 rlog10 差别的程度（log10 cfu/g）0.320.330.70正常比值的程度（cfu/g）2.102.145.03再现性标准偏差 SR（log10 cfu/g）0.500.48再现性限 R0.911.391.338.1224.6621.48表 B.2生

21、肉制品的数据分析结果低（2.4）中（3.7）高（3.8）2.433.723.750.150.130.100.420.360.272.652.281.860.280.570.791.021.616.1010.3840.7表 B.3饲料的数据分析结果低（1.5）中（2.5）高（3.5）201.602.503.530.080.340.230.242.191.681.720.180.170.200.460.563.142.903.65表 B.4巴氏灭菌乳的数据分析结果1.532.403.460.140.110.400.302.000.190.670.490.544.663.103.45表 B.5提拉米苏的数据分析结果参与合作