生物科技行业NBF考研辅导班与生技论坛联合免费辅导生物化学计划Word格式.docx
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例如,视觉信息的传递有视紫红质参与,感受味道需要味觉蛋白。
视杆细胞中的视紫红质,只需1个光子即可被激发,产生视觉。
9.遗传调控功能遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。
DNA在储存时是缠绕在蛋白质(组蛋白)上的。
有些蛋白质,如阻遏蛋白,与特定基因的表达有关。
β-半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制,当需要合成β-半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。
10.其他功能某些生物能合成有毒的蛋白质,用以攻击或自卫。
如某些植物在被昆虫咬过以后会产生一种毒蛋白。
白喉毒素可抑制生物蛋白质合成。
二、蛋白质的水解【常见考点】
氨基酸是蛋白质的基本结构单位,这个发现是从蛋白质的水解得到的。
蛋白质的水解主要有三种方法:
1.酸水解用6MHCl或4MH2SO4,105℃回流20小时即可完全水解。
酸水解不引起氨基酸的消旋,但色氨酸完全被破坏,丝氨酸和苏氨酸部分破坏,天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。
如样品含有杂质,在酸水解过程中常产生腐黑质,使水解液变黑。
用3mol/L对甲苯磺酸代替盐酸,得到色氨酸较多,可像丝氨酸和苏氨酸一样用外推法求其含量。
2.碱水解用5MNaOH,水解10-20小时可水解完全。
碱水解使氨基酸消旋,许多氨基酸被破坏,但色氨酸不被破坏。
常用于测定色氨酸含量。
可加入淀粉以防止氧化。
3.酶水解酶水解既不破坏氨基酸,也不引起消旋。
但酶水解时间长,反应不完全。
一般用于部分水解,若要完全水解,需要用多种酶协同作用。
第二节氨基酸
一、20种氨基酸简述
名称
英文
三字符
单字符
结构
特性
甘氨酸
glycine
Glu
G
无手性C
丙氨酸
alanine
Ala
A
缬氨酸
valine
Val
V
大脂肪侧链
亮氨酸
leucine
Leu
L
异亮氨酸
isoleucine
Ile
I
甲硫氨酸
methionine
Met
M
脯氨酸
proline
Pro
P
唯一成环氨基酸,氨基酸的侧链既与碳原子结合又与氨基N-原子结合,缺少H-bonddonor,无法形成α螺旋结构
苯丙氨酸
phenylalanine
Phe
F
侧链有芳香环,疏水氨基酸
酪氨酸
tyrosine
Tyr
Y
酪氨酸的芳香环有一个羟基。
与其他氨基酸侧链呈化学惰性相比,酪氨酸的羟基有化学反应性,疏水性弱。
色氨酸
tryptophan
Trp
W
吲哚基团替代丙氨酸侧链的氢原子。
吲哚基团有的两个环融合在一起,一个环有NH基团。
有NH故疏水性弱。
丝氨酸
serine
Ser
S
侧链有极性但不带电荷。
侧链有羟基与脂肪链相连。
亲水,其反应活性比丙氨酸和缬氨酸大得多。
苏氨酸
threonine
Thr
T
亲水,其反应活性比丙氨酸和颉氨酸大得多。
有第二个不对称碳原子,但蛋白质的苏氨酸只有一种构型。
天冬酰胺
asparagine
Asp
A
极性但不带电荷。
含酰胺的极性氨基酸
谷氨酰胺
glutamine
Gln
Q
半胱氨酸
cysteine
Cys
C
极性不带电。
结构上类似苏氨酸,但是用巯基替代了羟基。
巯基比羟基活泼。
一对巯基靠近可以形成二硫键,稳定蛋白质的结构。
赖氨酸
lysine
Lys
K
带电荷的氨基酸,高度亲水,侧链长,末端是氨基,在中性pH时侧链末端带正电荷。
精氨酸
arginine
Arg
R
带电荷,高度亲水,侧链长,末端是胍基,在中性pH时侧链末端带正电荷。
组氨酸
histidine
His
H
带电荷,高度亲水,侧链含有咪唑基,咪唑基是芳香环,可质子化后带正电荷。
咪唑的pKa值接近于6,在中性pH附近的溶液中咪唑基既可质子化也可不带电荷,取决于咪唑基团所在的局部环境。
组氨酸常在酶的活性中心。
在酶促反应中咪唑环既可结合质子,又可释放质子。
天冬氨酸
aspartate
D
酸性氨酸。
常被称为天冬氨酸盐,主要是强调在生理pH溶液中侧链基团解离,因此带负电荷。
在有些蛋白质中这两种氨基酸的作用是接受质子,对蛋白质功能起重要作用。
谷氨酸
glutamate
E
主要是强调在生理pH溶液中侧链基团解离,因此带负电荷。
1.按照R基的化学结构分类
(1)R为脂肪烃的氨基酸(5种):
Gly、Ala、Val、Leu、Ile
A.R基为中性烷基(Gly为H),对分子酸碱性影响很小,几乎有相同的等电点(6.0)
B.从Gly至Ile,R基团疏水性增加,Ile是这20种3氨基酸中脂溶性最强的之一(除Phe2.5、Trp3.4、Tyr2.3以外)
C.一般位于在蛋白质内部,侧链不被修饰
(2)R中含有羟基的氨基酸(2种):
Ser和Thr
A.Ser的-OH基是极性基团,易与其它基团形成氢键,具有重要的生理意义,在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基
B.Thr中的-OH是仲醇,具有亲水性,但形成氢键的能力较弱,在酶的活性中心很少出现
(3)R中含硫的氨基酸(2种):
Cys、Met
A.Cys(半胱氨酸)R中含巯基-SH两个Cys的-SH氧化生成二硫键,生成胱氨酸。
Cys-SH+Cys-SH——Cys-S-S-Cys,二硫键利于蛋白质结构的稳定
B.Met中含有甲硫基(-S-CH3)在生物合成中是一种重要的甲基供体
(4)R中含有acidicgroup的氨基酸(2种):
Asp、GluAsp侧链羧基pKa(β-COOH)为3.86;
Glu侧链羧基pKa(γ-COOH)为4.25它们在生理条件下带有负电荷
(5)R中含有酰胺基团的氨基酸(2种):
Asn、Gln
易发生氨基转移反应,转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义。
(6)R中含氨基的氨基酸(2种):
Basicaminoacids,Lys、Arg
A.Lys的R侧链上含有一个氨基,pKa为10.53,生理条件下Lys侧链带有一个正电荷。
此外,它的侧链有4个C,柔性较大,使侧链氨基的反应活性增大
B.Arg是碱性最强的氨基酸,pKa为12.48,生理条件下完全质子化
(7)R中含有芳香基的氨基酸(2种):
Phe、Tyr
都具有共轭π电子体系,易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物
(charge-transfercomplex),在分子相互识别过程中具有重要作用。
这2种氨基酸在紫外区有特征吸收峰。
(8)R为杂环的氨基酸(3种):
Trp、His、Pro
A.在280nm,Trp吸收最强,Tyr次之,Phe最弱
B.His的咪唑环pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同,前者pKa为6.00,后者为7.35,它是20种氨基酸中侧链pKa值最接近生理pH值的一种,在接近中性pH时,可离解平衡,具有缓冲能力
C.Pro是唯一的一种环状结构的氨基酸,它的α-亚氨基是环的一部分,因此具有特殊的刚性结构。
多肽链中,Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化,它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用。
2.按照R基的极性可以分为4类
(1)非极性氨基酸Nonpolaraminoacids(8种)
Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Pro,在水中溶解度较小,在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。
(2)不带电荷的极性氨基酸Polar,unchargedaminoacids(7种)
Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、Gly,这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键,因此很容易溶于水。
(3)带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)Acidicaminoacids(2种):
Glu和Asp
(4)带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)Basicacids(3种)Arg、Lys、His
非极性氨基酸一般位于蛋白质的疏水核心,带电荷的氨基酸和极性氨基酸位于蛋白质表面。
酶的活性中心:
His、Ser
二、肽peptide
(一)肽和肽键的结构
一个氨基酸的α羧基和另一个氨基酸的α氨基脱水缩合而成的化合物。
其中的氨基酸单
位称氨基酸残基。
肽键:
氨基酸间脱水后形成的酰氨键。
两个氨基酸形成的肽——二肽。
少于10个氨基酸
的肽——寡肽。
多于10个氨基酸的肽——多肽。
肽键的结构特点:
(1)酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用,形成共振杂化体,
稳定性高。
(2)肽键具有部分双键性质,不能自由旋转,具有平面性,6个原子几乎处在同一平面内
(酰氨平面)。
(3)肽键亚氨基在pH0-14内不解离
(4)肽链中的肽键一般是反式构型,而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型
(二)肽的重要性质
1.旋光性:
一般短肽的比旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和
2.肽的酸碱性质
在pH0―14范围内,肽键中的亚氨基不解离。
肽的酸碱性质主要取决于N端α-NH2
和C端α-COOH以及侧链R上可解离的基团。
在长肽或protein中,可解离的基团主要是
sidegroups(侧基)。
3.肽的化学反应
肽的α-羧基,α-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。
凡是
有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应,且可用于定性、定量分析。
双缩脲反应是peptide和protein特有的反应,游离氨基酸无此反应。
CuSO4与双缩脲反应,
生成紫红色或蓝紫色复合物。
(三)天然存在的活性肽
活性肽:
生物体内有很强生物活性的寡肽或多肽
1.谷胱甘肽Glu—Cys—Gly
在细胞内参与氧化还原过程,清除内源性过氧化物和自由基。
维护protein活性中心的巯基
处于还原状态。
2GSH——GS—SG
H2O2+2GSH——2H2O+GS—SG
2.短杆菌肽(抗生素)
由短杆菌产生的10肽环,抗菌。
L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Va
Orn-鸟氨酸
3.脑啡肽(5肽,具有镇痛作用,已发现几十种。
)
Met---脑啡肽:
Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
Leu---脑啡肽:
Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu
Leu---脑啡肽,既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。
4.生物体内寡肽的来源:
(1)合成蛋白质的剪切、修饰
(2)酶专一性逐步合成(如谷胱甘肽)
(3)动物肠道可吸收寡肽
三、Sequenceprimarystructure(一级结构序列,共价结构)
一级结构意义:
protein一级结构(序列)中含有形成高级结构全部必需的信息,一级结构决定高级结构及功能。
推断:
氨基酸序列(一级结构)——空间结构
预测:
空间结构(高级结构)——功能
蛋白质测序步骤
(一)protein测序的一般步骤
1.测定protein分子中多肽链的数目
2.拆分protein分子中的多肽链
3.测定多肽链的氨基酸组成
4.断裂链内二硫键
5.分析多肽链的N末端和C末端
6.多肽链部分裂解成肽段
7.测定各个肽段的氨基酸顺序
8.确定肽段在多肽链中的顺序
9.确定多肽链中二硫键的位置
(二)protein测序的基本策略
对于一个纯protein,理想的方法是从N端直接测至C端,目前只能测60个N端氨基
酸。
1.直接法(测protein的序列)
两种以上特异性裂解法:
NC
A法裂解A1A2A3A4
B法裂解B1B2B3B4
2.间接法(测定核酸序列,推断氨基酸序列)
(三)测序前的准备工作
1.protein的纯度及均一性鉴定
要求:
纯度97%以上,均一
两种以上纯度鉴定方法才可靠
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS-Cl(二甲氨基萘磺酰氯)测N端氨基酸
2.测定分子量
用于估算氨基酸残基数n=M/110
方法:
SDS-PAGE、凝胶过滤法、沉降系数法、渗透压法
3.确定亚基种类及数目
⑴拆离四级结构:
SDS-PAGE测亚基分子量,8mol/L尿素,SDS
⑵拆离二硫键
过甲酸氧化—S—S—+HCOOOH→—SO3H或β巯基乙醇还原
举例:
血红蛋白(α2β2)
分子量:
M拆亚基:
M1、M2两条电泳带拆二硫键:
M1、M2两条电泳带
分子量关系:
M=2M1+2M2
4.测定氨基酸组成
酸水解、碱水解
确定肽链中各种氨基酸出现的频率,便于选择裂解方法及试剂
5.端基分析
①N端分析
DNS-Cl法:
黄绿色荧光,灵敏度高,薄层层析,方法简便
DNFB法:
Sanger试剂,DNP-多肽,酸水解,黄色DNP-氨基酸,液相色谱等
PITC法:
Edman法,逐步切下,无色PTH-氨基酸,液相色谱分析
②C端分析
A.肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH
无水肼NH2NH2,100℃,5-10h
A-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH氨基酸的酰肼,用苯甲醛沉淀,C端在上清中,
Gln、Asn、Cys、Arg不能用此方法
B.羧肽酶法(Pro不能用此方法)
羧肽酶A:
除Pro、Arg、Lys外的所有C端氨基酸
羧肽酶B:
只水解Arg、Lys
(四)肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
1.化学裂解法
①溴化氰—Met—X—产率85%
②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%
③NTCB(2-硝基-5-硫氰苯甲酸)—X—Cys—
④羟胺NH2OH—Asn—Gly—约150个_______氨基酸出现一次
2.酶法裂解
①胰蛋白酶Lys—X(X≠Pro),Arg—X__②胰凝乳蛋白酶Tyr—X(X≠Pro)
Trp—X,Phe—X
③胃蛋白酶
Phe(Trp、Tyr、Leu)—Phe(Trp、Tyr、Leu)
③Glu蛋白酶Glu—X
④Arg蛋白酶Arg—X
⑤Lys蛋白酶X—Lys
⑥Pro蛋白酶Pro—X
3.肽段的分离纯化
①电泳法SDS-PAGE根据分子量大小分离
②离子交换层析法(DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex):
根据肽段的电荷特性分离
③反相HPLC法:
根据肽段的极性分离
④凝胶过滤根据分子量大小分离
4.肽段纯度鉴定
分离得到的每一个肽段,需分别鉴定纯度。
常用DNS-Cl法
SDS-PAGE单带、HPLC单峰、N端单一
(五)肽段的序列测定及肽链的拼接
1.Edman法:
一次水解一个N端氨基酸
(1)耦联PITC+H2N—A-B-C-DpH8-9,40℃
——PTC—A-B-C-D
(2)裂解PTC—A-B-C-D+TFA无水三氟乙醇
——ATZ—A+H2N—B-C-D
(3)转化ATZ—A——PTH—A
PTC肽:
苯氨基硫甲酰肽ATZ:
噻唑啉酮苯胺(-氨基酸)
PTH:
苯乙内酰硫脲(-氨基酸)
2.DNS-Edman法
用DNS法测N末端,用Edman法提供(n-1)肽段
A-B-C-D-E肽
3.有色Edman法
荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂
4.自动序列分析仪测序
仪器原理:
Edman法,可测60-70肽
1967液相测序仪,自旋反应器,适于大肽段
1971固相测序仪,表面接有丙氨基的微孔玻璃球,可耦连肽段的C端
1981气相测序仪,用Polybrene反应器(聚阳离子)四级铵盐聚合物
液相:
5nmol20-40肽97%
气相:
5pmol60肽98%
5.肽段拼接成肽链
16肽,N端H,C端S
A法裂解:
ONSPSEOVERLAHOWT
B法裂解:
SEOWTONVERLAPSHO
重叠法确定序列:
HOWTONSEOVERLAPS
(六)二硫键、酰胺及其它修饰基团的确定
1.二硫键的确定(双向电泳法)碘乙酰胺封闭-SH胃蛋白酶酶解protein
第一向电泳:
过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向电泳:
分离出含二硫键的两条短肽,测序。
与拼接出的肽链比较,定出二硫键的位置。
2.酰胺的确定
Asp—Asn、Glu—Gln
酶解肽链,产生含单个Asx或Glx的肽,用电泳法确定是Asp还是Asn
Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时,电荷量是Leu+Pro0Val-
此肽除Glx外,净电荷为0,可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln
3.糖、脂、磷酸基团位置的确定
糖类通过Asn、Ser与protein连接,-N-糖苷-0-糖苷
脂类:
Ser、Thr、Cys
磷酸:
Ser、Thr、His
经验性序列:
Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4),Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg)–Ala-Ser(PO4)
第五节多肽与蛋白质的人工合成
氨基用叔丁氧甲酰基(BOC)保护
C端→N端
挂接→去保护→中和→缩合→(去保护→中和→缩合)n→多肽__第三节蛋白质的高级结构
一、蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质
(一)肽链的构象(conformation)
多肽链上α-碳原子都参与形成单键,一个多肽主链可能有无限多种构象。
已知一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种稳定构象,这种构象称天然构象。
天然构象蛋白质具有生物活性,主链上的单键不能自由旋转。
1.肽链的二面角(dihedralangle)
α碳原子连接的两个键(α-N1和α-C2)是单键,能自由旋转。
绕α—N1键旋转的角度为Φ绕α—C2键旋转的角度称Ψ
当Φ的旋转键Cα-N1两侧的N1-C1和Cα-C2呈顺式时,规定Φ=0°
。
当Ψ的旋转键Cα-C2两侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时,规定Ψ=0°
从Cα向N1看,顺时针旋转Cα-N1键形成的Φ角为正值,反之为负值。
从Cα向C2看,顺时针旋转Cα-C2键形成的Ψ角为正值,反之为负值。
2.多肽链折叠的空间限制
Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在。
二面角(Φ、Ψ)所决定的构象能否存在,主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的
接近有无阻碍。
Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ。
蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。
拉氏构象图:
Ramachandran根据蛋白质中非键合原子(non-covelently-bondedatom)间的最
小接触距离,确定了哪些二面角(Φ、Ψ)所确定的两个相邻肽单位的构象是允许的,哪些
是不允许的,并且以Φ为横坐标,以Ψ为纵坐标在坐标图上标出,该坐标图称拉氏构象图。
⑴实线封闭区域(一般允许区):
非键合原子间的距离大于一般允许距离,此区域内任何二
面角确定的构象都是允许的,且构象稳定。
⑵虚线封闭区域(最大允许区):
非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之
间,立体化学允许但构象不够稳定。
⑶虚线外区域(不允许区):
该区域内任何二面角确定的肽链构象非键合原子间距离小于最
小允许距离。
(二)二级结构的基本类型:
驱使蛋白质折叠的主要动力-熵效应主要有两点:
第一暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。
第二要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。
1.α螺旋(α-helix)
(1)特征:
多肽主链按右手或左手方向盘绕,形成右手螺旋或左手螺旋,相邻的螺圈之间
形成链内氢键,构成螺旋的每个Cα都有相同的二面角Φ、Ψ。
典型α螺旋(3.613)的特征:
1二面角Φ=-57°
Ψ=-48°
,右手螺旋;
2每圈3.6个氨基酸残基,高度0.54nm