微生物检验实际操作作业指导书定稿Word文档下载推荐.docx

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c）培养基的灭菌时间和温度，需按照规定进行，以保证杀菌效果和不损失培养基的必要成份。

d）培养基的灭菌时间和温度，需按照规定进行，以保证杀菌效果和不损失培养基的必要成份。

2样品的采集、处理和稀释

2.1操作方法

（1）以无菌操作取待检样25g（或25mL），放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的无菌锥形瓶内，经充分振荡、研磨或均质，制成1：

10的均匀稀释液。

（2）用1mL灭菌吸管或移液器吸取1：

10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：

100的稀释液。

（3）另取1mL灭菌吸管，从1:

100稀释液中吸取1：

1000的稀释液。

（4）其它浓度稀释液可按照以上操作方法制备。

2.2注意事项

（1）样品的采集和处理。

a）如系肉、鱼等固体样品，为保证试样分布均匀，最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀，或与稀释液同置于灭菌均质器杯中，以8000-l0000rpm速度搅拌1分钟。

b）如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。

固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

（2）无菌操作。

a）操作中必须有“无菌操作”的概念，检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。

所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。

b）样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。

c）操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。

d）从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；

而且吸管在进出装有稀释液的锥形瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分。

（3）样品稀释

a）为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一做稀释度应更换一支吸管。

b）在进行稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内。

c）用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。

如果在琼脂对照平板上出现菌落时，要追加对照平板，以判定是用于培养基、平皿、吸管或是空气存在污染。

d）当用吸管将检样稀释液加至另一装9m空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液。

（4）稀释液

a）样品稀释液主要是使用灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液），后者对已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。

b）如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。

3倾注平板

3.1操作过程

（1）根据标准要求及产品特点，选择2-3个适宜稀释度，分别在进行10倍递增稀释的同时，各吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，将冷却至46℃培养基注入平皿约15mL，转动平皿，混合均匀。

每个稀释度做两个平皿。

（2）将1mL空白稀释液（不含样品）加入灭菌平皿内，注入平皿约15mL，转动平皿，混合均匀作空白对照。

每批样品做2个空白对照平皿。

（3）待琼脂凝固后，翻转平板，置于36±

1℃培养箱内培养48±

2h。

3.2注意事项

（1）经过灭菌的培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。

（2）为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应迅速倾入培养基，并立即使其与琼脂混和均匀。

（3）倾注培养基的量一般以15mL为宜，平板过厚影响观察，太薄培养基又易于干裂。

倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。

（4）为使菌落能在平板上均匀分布，当检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转。

旋转中应加小心，不要使混和物溅到皿边的上方。

（5）从开始稀释到完成倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min。

（6）皿内琼脂凝固后，应立即翻转，送入培养箱中进行培养。

4培养

4.1操作过程

培养温度36℃，48h（水产品由于其生活环境水温较低，故多采用30℃，72h）。

4.2注意事项

（1）箱内的培养物不宜放置过挤，以便于热空气对流，无论放入或取出物品应随手关门，以免温度波动。

（2）培养箱应定期清洁消毒：

可先用干净抹布擦洗，再用棉布蘸取75%的酒精擦洗消毒，通风10分钟。

（3）培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。

（4）特殊产品为了避免样品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。

5菌落计数

5.1计数

（1）到达规定培养时间，应立即计数。

如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。

（2）培养到时间后，可用肉眼计数每个平板上的菌落数，必要时可用放大镜或菌落计数器检查。

（3）计数过程中记录不同稀释度平板及空白对照上的菌落数。

（4）选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。

每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

（5）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；

若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

（6）当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

5.2注意事项

（1）不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。

如出现逆反现象，则应视为检验中的差错，不应作为检样计数报告的依据。

6菌落总数结果与报告

6.1菌落总数的计算方法

（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。

（2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下列公式计算：

（1）

式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

（3）若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

（4）若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

（5）若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

（6）若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

6.2菌落总数的报告

（1）菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

（2）菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；

也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

（3）若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

（4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

（5）称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

7检验记录表格样本

表1：

菌落总数测定原始记录样本

稀释度

（第一稀释度）

（第二稀释度）

菌落数（CFU）

报告

8其他注意事项

（1）为了控制污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间，应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当，然后与加有检样的平皿一并置于培养箱内培养，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。

（2）由培养基或试管培养物中沾取标本时，培养瓶口、试管口在打开后及关闭前，应于火焰上通过1～2次，以杀死可能从空气中落入的杂菌和由培养物而来的致病菌。

打开瓶塞或试管塞时，应将棉塞上端夹于手指间适当的位置，不得将棉塞任意放置别处。

（3）如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则系检验工作中发生的差错，属实验室事故，此外，也可能因抑菌剂混入样品中所致，均不可用作检样计数报告的依据。

（4）如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细菌块被分散所造成，一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。

此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。

二、大肠菌群测定作业指导书

（一）大肠菌群测定过程概述

大肠菌群系指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，大肠菌群一般包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群检验的基本操作一般包括：

培养基的制备→灭菌→样品的稀释→初发酵→复发酵→计数报告。

（二）大肠菌群测定过程及注意事项

1.1培养基的称量

（1）双料LST肉汤的配制：

称取月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤琼脂培养基（杭州天和）72g，加1000mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌，边加水边搅拌，使培养基溶解。

（2）单料LST肉汤的配制：

称取月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤琼脂培养基36g，加1000mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌，边加水边搅拌，使培养基溶解。

（3）煌绿乳糖胆盐的配置：

称取煌绿乳糖肉汤20g于500mL的烧杯中，加500mL的蒸馏水，边加水边搅拌，溶解混匀。

1.2灭菌

（1）将搅拌均匀的月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）肉汤分装于放有小导管（小导管倒置）的试管中，每个稀释度分装3管，每管10ml，用硅胶塞密封。

（2）将所有试管用硅胶塞或棉塞塞紧，用牛皮纸包裹捆扎，使硅胶塞不裸露与外边。

（3）将培养基与实验所需要的其他物品在121℃高压下保持15分钟，完成灭菌后，将灭菌锅进行排气。

（4）注意事项：

蒸汽灭菌中，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，会大大降低灭菌效果。

（1）固体和半固体样品：

称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:

10的样品匀液。

（2）液体样品：

以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:

（3）样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。

（4）用10ml无菌吸管吸取1：

10样品匀液10ml，接种3管双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤。

（5）用1mL无菌吸管吸取1:

10样品匀液1mL，接种3管单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤。

（6）用1mL无菌吸管吸取1:

10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），使其混合均匀，制成1:

100的样品匀液。

（5）用1mL无菌吸管吸取1:

100样品匀液1mL，接种3管单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤。

（7）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。

每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

3初发酵试验

36℃±

1℃培养24h±

2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±

2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±

2h，产气者进行复发酵试验。

未产气者为大肠菌群阴性。

4复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLG）。

在36℃±

1℃的培养箱内培养48h±

2h，观察产气情况。

产气者，计为大肠菌群阳性管。

5大肠菌群检验记录表格样本（表3或表4）

表3：

大肠菌群检测原始记录样本1

检样量

1g（ml）

0.1g（ml）

0.01g（ml）

阳性管数

MPN

大肠菌群检测原始记录样本2

0.001g（ml）

6大肠菌群最可能数（MPN）的报告

（1）按复发酵试验确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

7大肠菌群测定过程中注意事项

接种环或接种针每次使用前后，均须火焰灭菌，即在酒精灯火焰上彻底烧灼。

三、微生物检验常见问题答疑

1、食品的细菌污染有哪些？

食品中常见的细菌包括致病菌、相对致病菌和非致病菌；

食品细菌污染主要是指非致病细菌的污染；

食品细菌污染是衡量食品污染程度、估测食品变质可能性及评价食品卫生质量的重要指标。

2、微生物检验中有哪些常用的样品处理方法？

振摇-----容易溶解和分散到稀释剂的样品，可以用此方法。

研钵------适合固体、半固体、非水溶性样品，但比较费时费力。

拍击式均质器-----适合固体、半固体的样品。

但比较硬的样品，不容易均匀，而且袋子容易烂。

旋转式均质器-----又叫匀浆仪，适合大多数样品。

3、微生物检验过程中可用于吸取、转移液体的实验仪器有哪些？

刻度吸管+吸球。

这是最常用的方法，一般是与吸球配合使用，但是操作比较麻烦，初学者不易掌握好所需吸取液体量。

刻度吸管+大容量手动移液器。

大容量手动移液器采用灵敏的吸液排液控制杆，使吸液和排液能得到精确控制，符合人机工效学学设计，操作舒适、便于使用，移液范围0.1-100mL之间，具有操作简便，速度快，吸取液体方便快捷的优势。

移液器。

常用于实验室少量或微量液体的移取，规格不同，具有操作简单，方便快捷的优势。

4、为什么做菌落总数微生物空白时常有菌，而且是很大的，圆的，中间有小圈的菌？

原因一：

空白长菌，最可能的看生理盐水；

原因二：

吸管、平皿和无菌室的灭菌效果未达到要求；

原因三：

营养琼脂灭菌温度和时间是未达到要求。

5、灭菌对培养基是否有影响，若有，都有哪些影响？

答：

灭菌对培养基是有影响的：

a.pH值普遍下降；

b.产生混浊或沉淀；

c.不少培养基颜色加深；

d.体积和浓度有所变化；

e.营养成分有时受到破坏。

6、吸耳球能高压灭菌吗？

吸耳球是橡胶材质，不能用于高压灭菌，用酒精擦拭灭菌即可。

7、菌落总数超标的原因是什么？

（1）可能是原料本身所含的菌落数就多；

（2）可能是包装袋、包装车间、员工消毒情况等因素造成了污染，导致菌落总数超标；

（3）检测过程可能有错误操作。

四、食品微生物检验实验室要求

食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：

一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止对检验人员造成伤害。

（一）无菌操作要求

（1）进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。

（2）接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。

（3）进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。

（4）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。

（5）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。

（6）接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰灼烧。

（7）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸橡皮管的方式。

（二）无菌室使用要求

（1）无菌室通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌室大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌室后传递物品。

（2）无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。

（3）无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离地面不超过1.5m，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。

（4）处理和接种食品样本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。

（5）在无菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。

（三）消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。

1、干热灭菌注意事项

（1）此法适应于在干热情况下，不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。

（2）灭菌前将所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，如用金属筒应将上面通气孔打开。

（3）装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。

（4）检查设备是否正常。

（5）灭菌时将箱门关紧，接上电源，先将排气孔打开约30min，排除灭菌器中的冷空气，温度升至160℃调节指示灯，维持2h。

（6）灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。

2、压力蒸气灭菌器使用注意事项

（1）使用蒸馏水。

（2）灭菌锅内水位正常（水位没过电热管）。

（3）手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。

（4）盖好灭菌锅盖，对称拧紧顶盖旋钮，勿使漏气，并打开顶盖上的排气阀放冷气（水沸腾后排气10-15min）。

（5）关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（一般为15min）。

（6）达到规定时间后，打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物。

3、有毒有菌污物处理要求

（1）微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。

（2）经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。

（3）经微生物污染的培养物，必须经121℃，30min高压灭菌。

（4）染菌后的吸管，使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃，30min高压灭菌。

（5）涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。

做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。

（6）打碎的培养物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。

（7）污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。

（四）培养基制备要求

培养基制备的质量将直接影响微生物生长。

因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：

（1）根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。

（2）PH测定及调节：

PH测定要在培养基冷却，但仍为溶液状态时进行。

（3）培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况。

（4）盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。

（5）培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。

（五）样品采集及处理要求

（1）所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。

（2）根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。

（3）采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。

（4）样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。

（5）检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况