尿中二氯甲烷的测定气相色谱法 编制说明Word文档格式.docx

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张万超

科员/主管技师

实验室检测

3

朱宝立

中心书记/主任医师

江苏省疾病预防控制中心

项目指导、咨询

4

李小娟

女

科员/主任技师

方法验证

5

周伟

科主任/副主任医师

深圳市职业病防治院

现场调查

6

李添娣

科员/副主任技师

7

于碧鲲

副主任医师/科长

深圳市龙岗区疾病预防控制中心

现场调查采样

8

蔡志斌

主任技师/科长

9

唐慧晶

科员/医师

10

赵淑岚

科主任/研究员

项目指导

11

曾强

副所长/主任医师

项目咨询

天津市疾病预防控制中心承担并负责本标准的起草编制工作，参加起草单位有江苏省疾病预防控制中心、深圳市职业病防治院、深圳市龙岗区疾病预防控制中心。

本标准主要起草人及分工如下：

（三）起草过程

1.前期基础

2013至2018年，项目组前期通过查阅国内外二氯甲烷相关文献资料，获取二氯甲烷（Dichloromethane，二氯甲烷）的理化性质、毒理学、代谢动力学、职业卫生学资料，以及国外对二氯甲烷规定的生物接触限值及其制定依据，在获取大量信息的基础上，制定实施方案，并进行讨论、修改。

选择华南某制胶化工企业进行职业卫生现场调查，对作业场所空气中二氯甲烷浓度和工人班末尿中二氯甲烷进行检测；

并选择健康人群进行非职业接触流行病学调查，主要内容包括人群健康状况，并对外环境空气中二氯甲烷浓度和健康人群尿中二氯甲烷进行检测，采样和检测方法同上，提出我国二氯甲烷生物接触限值0.3mg/L，并经GBZ2.1-2019颁布。

但目前与之相配套的尿中二氯甲烷测定方法相关标准尚未提出。

2.项目启动

为建立二氯甲烷相应的生物监测方法标准，更客观地监测劳动者接触二氯甲烷的水平，在上述研究基础上，项目组启动了尿中二氯甲烷测定方法的制定工作。

项目组成员由天津市疾病预防控制中心、江苏省疾病预防控制中心、深圳市职业病防治院、深圳市龙岗区疾病预防控制中心相关专业技术人员组成，天津市疾病预防控制中心为项目主承担单位，项目负责人为天津市疾病预防控制中心张明主任医师，江苏省疾病预防控制中心、深圳市职业病防治院、深圳市龙岗区疾病预防控制中心为方法验证单位。

2019年10月底启动标准编制起草工作，确定《尿中二氯甲烷的测定气相色谱法》编制起草框架，起草小组对标准相关技术材料进行整理，并确定编制起草方案。

3.工作进程

（1）标准方法的建立

2019年9月～2019年10月主承担单位天津市疾病预防控制中心根据GBZ/T210.5-2008《职业卫生标准制定指南第5部分：

生物材料中化学物质测定方法》的技术要求，在前期研究工作，通过对样品采集与处理、色谱条件、检测参数的选择与确定、标准曲线绘制、方法的线性范围及检出限、顶空温度、时间的选择、无水硫酸钠加入量试验、样品体积选择、方法精密度和准确度试验、萃取效率、稳定性试验、干扰实验、现场验证等对该方法进行评估，建立尿中二氯甲烷的气相色谱法。

（2）方法验证

2019年11月～2020年3月项目参与单位江苏省疾病预防控制中心、深圳市职业病防治院、深圳市龙岗区疾病预防控制中心根据GBZ/T210.5-2008《职业卫生标准制定指南第5部分：

生物材料中化学物质测定方法》的要求，对本方法进行验证，出具标准方法验证报告。

4.文本修改过程

（1）起草初稿。

2020年4月在项目组上述工作基础上，通过对标准研究资料的整理、归纳和分析，形成标准框架，起草标准文本初稿及编制说明。

（3）专家讨论。

2020年5月项目组专家通过电话、网络视频等方法，对标准初稿进行了讨论与修改，形成标准征求意见稿。

（4）社会征求意见

2020年6月～2020年9月，项目组向职业卫生行政管理部门、职业卫生监督机构、职业卫生检验机构的专家和监管人员以及和二氯甲烷生产及使用企业征求意见，共计发出征求意见函xx份，收回xx份。

2013年1月上旬、下旬在南京先后召开了2次标准研讨会，对函审专家和有关单位对81个标准条目共计147条意见和建议进行了逐条分析、讨论，形成标准送审稿。

2020年7月起本标准征求意见稿在卫生健康标准网向全国广泛征求意见，截止2020年XXX月未收到反馈的修改意见和建议。

（4）社会意见研究处理过程和结果。

（5）标委会委员意见及处理情况。

（6）标委会预审会议意见及处理情况。

（7）研制过程中所做的重大修改和调整。

（8）标准审查结果及审查意见处理情况。

5.项目完成情况（以完成报批稿发送秘书处并在系统上提交为最后完成节点）。

二、与相关规范性文件和其他标准的关系

本标准属于职业健康限值标准，为《职业接触二氯甲烷的生物接触限值》的配套方法标准，是职业卫生标准的重要组成部分。

三、国外相关规定和标准情况的对比说明

美国ACGIH推荐二氯甲烷的生物接触指数（biologicalexposureindex，BEI）班后尿为0.3mg/L二氯甲烷，这个值的基础是ACGIH的工作场所8小时接触TLV-TWA177mg/m3（50ppm），与我国目前规定工作场所空气中二氯甲烷的8小时时间加权平均容许浓度（PC-TWA）200mg/m3（56.5ppm）大致相当，本研究团队前期已制定二氯甲烷生物接触限值，提出我国二氯甲烷的生物接触限值0.3mg/L，但目前尿中二氯甲烷测定方法相关标准尚未提出。

本次申报检测方法标准为《职业接触二氯甲烷的生物接触限值》的配套方法标准，是职业健康标准的重要组成部分。

四、各项技术内容的依据

（一）原理与方法

1.原理

尿中二氯甲烷经顶空气相萃取预处理分离后，由填充柱分析，氢火焰离子化检测器（FID）检测，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。

2.仪器与试剂

日本岛津GC-14C型气相色谱仪，火焰离子化检测器（FID）、化学工作站软件；

FFAP填充柱；

恒温水箱；

1ml注射器等。

DCM（99.9%，美国Sigma-Aldrich公司）；

去离子水；

无水硫酸钠等。

DCM标准贮备液：

准确量取10μL色谱纯级二氯甲烷于100ml去离子水定容好的容量瓶中，充分混匀，此溶液为132.6μg/ml二氯甲烷标准储备液。

DCM标准应用液：

取标准贮备液10ml于100ml容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，为13.26μg/ml的标准应用液。

3.尿样的采集和处理

在清洁无污染的场所，用聚乙烯采尿瓶采集工人尿液，每批取2-3个采尿瓶作为样品空白。

在收集过程中避免尿样多次转移和外来物的污染，50ml尿样中加1～2滴浓盐酸，样品置于清洁容器冷藏运输。

准确量取7ml尿样于20ml顶空瓶中，加入6g无水硫酸钠，盖紧密封，摇匀，盖好，放置于60℃恒温保温箱30分钟，待体系平衡后，用注射器准确抽取顶空瓶顶部1ml气体，迅速注入到GC汽化室，经填充柱分析，FID检测器检测，以保留时间定性，峰面积定量。

4.色谱条件

柱温80℃；

汽化室：

150℃；

检测器：

200℃；

在0.1Mpa下，N2作为载气。

5.标准曲线绘制

取5只具塞比色管，分别加入用空白尿液将二氯甲烷应用液梯度稀释成0.0mg/l，0.166mg/l，0.332mg/l，0.663mg/l，1.326mg/l的标准系列。

按样品处理方式，参照仪器操作条件，将气相色谱仪调节至最佳测定状态，测定标准系列，每个浓度重复测定3次，以峰面积均值对DCM浓度绘制标准曲线，见图1。

图1尿中二氯甲烷检测的标准曲线

6.样品测定

使用1ml注射器进行手动进样，根据测得的峰面积从标准曲线中查出样品中DCM的浓度。

7.顶空温度的选择

配制一定二氯甲烷浓度的尿样，准确量取7ml尿样到顶空瓶中，加入6g无水硫酸钠盐，盖紧，摇匀，分别在20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃下，水浴30min，在相同色谱条件下进样分析，当平衡温度为60℃，气相中二氯甲烷含量最高，测定结果见图2。

图2温度对二氯甲烷提取效果的影响

8.顶空时间的选择

同样用空白尿液稀释二氯甲烷标准储备液，配制成一定浓度二氯甲烷应用尿液，在每只顶空瓶中都准确量取7ml该应用液，并加入6g无水硫酸钠盐，盖紧瓶塞，摇匀后，在60℃恒温水浴锅中，萃取不同时间（5min，10min，15min，20min，25min，30min，35min），在该实验的色谱条件下分析测定，随着水浴时间的不断延长，气相萃取的二氯甲烷含量稳定增加，在水浴时间30min后，气液两相达到平衡，结果见图3。

图3时间对二氯甲烷提取效果的影响

9.无水硫酸钠加入量试验

取相同体积相同浓度的二氯甲烷尿样，分别加入不同质量的无水硫酸钠，在60℃恒温水浴锅中，萃取30min，在该实验的色谱条件下分析测定，由结果可见,无水硫酸钠盐对尿液中二氯甲烷的盐析作用是明显的（见图4）。

图4无水硫酸钠对二氯甲烷提取效果的影响

10.样品体积选择

本实验采用20ml顶空瓶，瓶内分别装事先配好的2.652mg/L二氯甲烷溶液1,3,5,7,10ml，制成不同的体积比的样品各三份，每份加入6g无水硫酸钠，盖紧，摇匀后，在60℃恒温保温30min，在本实验条件下进行色谱分析，结果见图5。

当20ml的顶空瓶中，尿液体积为7ml时，易挥发的二氯甲烷蒸气在气相中的分配系数最大。

图5样品体积对二氯甲烷提取效果的影响

11.方法的线性范围和检出限

按标准方法配制标准系列，每个浓度测定3次，取其均值，以峰面积均值对DCM浓度（mg/ml）进行线性回归分析，得出回归方程为：

y=4023x-2.894.1，r=0.9995，根据标准差法计算检出限为：

0.01mg/ml。

12.精密度和准确度试验、萃取效率

分别取DCM三种浓度的样品，3天内重复测定6次，计算测定结果平均值，标准差及变异系数（RSD），结果表明，此低、中、高三种浓度的各6次测定结果精密度分别为9.06%、3.65%、5.77%，均小于10%。

结果见表1。

表1样品精确度实验结果

加标值

日内精密度

RSD

日间精密度

（μg）

（mean±

SD）

（%）

0.2

0.134±

0.008

5.97

0.132±

0.012

9.06

0.7

0.709±

0.032

4.51

0.712±

0.026

3.65

1.2

1.143±

0.054

4.72

0.066

5.77

准确度试验采用加标回收法，向样品中分别加入低、中、高不同含量的DCM标准溶液，每个浓度测定6次，以测定结果同加标含量计算回收率分别为78.6%、79.6%、87.3%，结果均在75-105%允许范围之间。

结果见表2。

表2样品准确度实验结果

实测值

平均实测值

SD）

平均加标率

0.15

0.120

0.112

0.121

0.123

0.114

0.116

0.118±

0.004

78.6%

0.3

0.241

0.244

0.238

0.231

0.233

0.245

0.239±

0.006

79.6%

0.6

0.533

0.521

0.527

0.525

0.515

0.523

0.524±

87.3%

萃取效率试验同样品回收率试验，结果大于75%，在允许范围之内。

13.稳定性试验

稳定性试验：

取空白尿液加入DCM标准溶液配制成一定浓度的样品，分成4组，每组6个样品，当天测定1组，其余-20℃冰箱保存，于第3、7、14天各测定1组。

以当天结果为100%，计算不同天数的样品损失率。

由结果得出，样品在-20℃冰箱中保存，建议样品尽量在2周内测定，结果见表3。

表3样品稳定性实验结果

放置时间

样品数

实测含量（x±

s，ng/ml）

损失率（%）

第1d

0.613±

0.034

第3d

0.598±

0.022

2.45%

第7d

0.595±

0.007

2.94%

第14d

0.545±

0.019

11.09%

14.干扰实验

取3名没接触过二氯甲烷的员工尿样混匀，加入适量的甲醇、正己烷和二甲苯并稀释至较低浓度，按照样品检测操作方法进行色谱分析。

见色谱分离图6，甲醇、正己烷和二甲苯，与二氯甲烷的色谱图是基本分离的，其中正己烷和二氯甲烷的保留时间较近，分别是1.503min和1.443min，但并未干扰二氯甲烷的测定。

图6二氯甲烷干扰分析图

（1-甲醇，2-二氯甲烷，3-正己烷，4-二甲苯）

（二）影响本法的主要因素

本法以ACGIH有关尿中的二氯甲烷检测方法等同引用。

1．在1周内，尿样保存在-20℃，RSD均小于5％，提示DCM在尿液中具有较好的稳定性。

2．尿样不能直接测定，尿中杂质可对测定产生干扰，必须进行前处理。

3．气相色谱仪条件需要给予充分的摸索，避免各种因素的影响。

（三）现场实验

采用本法对某企业使用DCM的工作场所工人（接触组），以及无职业接触的行政人员（对照组），各17人，进行尿样采集测定。

接触组有10人检出，结果为0.09、0.45、0.03、0.07、0.07、0.33、0.12、0.09、0.14、0.18mg/l，对照组均未检出。

结果表明本法适用性较好。

江苏省疾病预防控制中心、深圳市职业病防治院和深圳市龙岗区疾病预防控制中心分别对本方法进行了验证。

（四）本法的可行性

本法的各项性能指标符合GBZ/T210.5-2008《职业卫生标准制定指南第5部分：

生物材料中化学物质测定方法》的要求。